大鼠雌二醇（E2）ELISA檢測試劑盒如何操作更精確

大鼠雌二醇（E2）ELISA檢測試劑盒

檢測原理

試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被大鼠雌二醇（E2）捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品,、HRP標(biāo)記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的大鼠雌二醇（E2）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度,。

樣品收集,、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測,，請按一次用量分裝,，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

自備物品

1.     酶標(biāo)儀（450nm）

2.     高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL

3.     37℃恒溫箱

操作注意事項(xiàng)

1.  試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶,，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用,。

2.  實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存。

3.  預(yù)處理后的樣本無需稀釋,，直接取10μL加樣即可,。

4.  嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作,。

5.  所有液體組分使用前充分搖勻,。

試劑盒組成

注：標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：64、32,、16,、8、4,、0 pmol/L.

試劑的準(zhǔn)備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。

洗板方法

1.  手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次。

2.  自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min,，洗板5次。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

2.  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；

3.  待測樣本孔先加待測樣本10μL,，再加樣本稀釋液40μL；

4.  隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.  每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中,，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值,。

試劑盒性能

1.  準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900,。

2.  靈敏度：檢測濃度小于0.1 pmol/L,。

3.  檢測范圍：2 pmol/L - 64 pmol/L                                           

4. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

5.  重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%,、板間變異系數(shù)小于15%,。

6.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存,。

7.  有效期：6個(gè)月

免責(zé)聲明

1.   試劑盒僅供研究使用,，不得用于研究實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn)，否則所產(chǎn)生的一切后果,，由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān),，本公司概不負(fù)責(zé)。

2.   嚴(yán)格按照說明書操作,，實(shí)驗(yàn)者違反說明書操作,，后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)。

大鼠雌二醇（E2）ELISA檢測試劑盒如何操作更精確