信帆生物為您分享：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）要點(diǎn)

1　免疫吸附劑

　　已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個(gè)月,。有些不完整的試盒,，僅供應(yīng)包被用抗原或抗體，檢測人員需自行 包被,。以下簡述固相載體和包被過程,。

2　固相載體

　　固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng),?？勺?span>ELISA中載體的材料很多，常用的是聚苯乙烯,。聚苯乙烯具有較 強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能,，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性，加之它的價(jià)格低廉,，所以被普遍采用,。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式,。

　　ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板,、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用,，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板,，國際上標(biāo)準(zhǔn) 的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測,，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的,，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同,。ELISA板的特 點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測,，并可在特制的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果。現(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測,，包括加樣,、洗滌、保溫,、 比色等步驟,，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后,，其吸附性能特別是對(duì)免疫球蛋白的吸附性能增加,，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但 用于間接法測抗體時(shí)空白值較大,。

　　良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高,，各板之間,、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近,。聚苯乙烯ELISA板 由于原料的不同和制作工藝的差別,，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此,，每一批號(hào)的ELISA板在使用前須事先檢查其性能,。

常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體,，保 溫后洗滌,，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后,，分別測每孔溶液的吸光度,。控制反應(yīng)條件,，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右,。計(jì)算全部讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與全部 讀數(shù)的均數(shù)之差,，應(yīng)小于10%,。

　　與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體,，聚氯乙烯的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄,，可剪割，價(jià)廉,，但光潔度不如聚苯乙烯板,，孔底亦不如 聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高,，但空白值也略高,。

　　為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗(yàn)：用其他免疫學(xué)測定方法選出一個(gè)典型的陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本,，將它們進(jìn)行一系 列稀釋后,，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測定，然后比較結(jié)果,。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果差別最大,，這種載體就是這一 ELISA測定項(xiàng)目的最合適的固相載體。

　　在ELISA中,，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠,，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加,。ELISA板孔的吸附面積約為 200mm2，小珠均為1000mm2,，將近ELISA板孔的5倍,。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者,，球型小珠的表面弧度更有利于吸 附的抗原決定簇或抗體結(jié)合位點(diǎn)的暴露面處于最佳反應(yīng)狀態(tài),，因此珠式ELISA的反應(yīng)往往更為靈敏。小珠的另一特點(diǎn)是更易于使洗滌*,，使用特殊的洗滌器,， 使小珠在洗滌過程中滾動(dòng)淋洗，其洗滌效果遠(yuǎn)較板孔的浸泡式為好,。但由于磨砂工藝的難度較大,，小珠的均一性較差。

　　小試管作為固相載體也有較大的吸附表面,，而且標(biāo)本的反應(yīng)量也相應(yīng)增加,。板式及珠式ELISA的標(biāo)本量一般為100-200ul，而小試管可 根據(jù)需要加大反應(yīng)體積,，標(biāo)本反應(yīng)量的增加有助于試驗(yàn)敏感性的提高,。小試管還可以當(dāng)作比色杯，最后直接放入分光光度計(jì)中比色,。

　　也有應(yīng)用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的,。其優(yōu)點(diǎn)是表面積極大，反應(yīng)在懸液中進(jìn)行,，其速率與液相反應(yīng)近似,。以含 鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體，反應(yīng)后用磁鐵的吸引進(jìn)行分離,，洗滌方便,，試劑盒一般均配以特殊儀器。

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