本試劑盒采用JC-1一種陽離子脂質(zhì)熒光染料作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài),，在低濃度時以單體的形式存在,，高濃度時以多聚體形式存在，兩者的發(fā)射光譜不同,，但均可在流式細胞儀綠色（FL-1）通道檢測出綠色熒光,，JC-1可透過正常細胞膜以單體狀態(tài)聚集胞內(nèi)，正常健康線粒體的膜電位（△y）具有極性,，JC-1依賴于△y的極性被迅速攝入線粒體內(nèi),，并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體，多聚體發(fā)射光為紅色熒光,；可被流式細胞儀的紅色（FL-2）通道檢測到,，而細胞發(fā)生凋亡時,，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放,，紅光強度減弱,，以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。根椐這一特征檢測線粒體膜電位的變化,。本試劑盒可應用于細胞,、組織或純化的線粒體膜電位檢測。

操作步驟(僅供參考)：

1,、 配制JC-1染色工作液：

取適量JC-1 Stain (200×),，按照每50μl JC-1 Stain (200×)加入8ml ddH2O的比例稀釋JC-1，劇烈Vortex充分溶解并混勻JC-1,。然后再加入2ml JC-1 Buffer(5×),，混勻后即為JC-1染色工作液。6孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1ml,，其它培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推,。

2、 設(shè)置陽性對照：

推薦CCCP(10mM)加入到細胞培養(yǎng)液中處理細胞,。隨后按照下述方法裝載JC-1,，進行線粒體膜電位的檢測。對于特定的細胞,，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同,，需自行參考相關(guān)文獻資料確定。

3,、對于懸浮細胞：

a. 取1～6×105細胞,，重懸于0.5ml細胞培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅,。

b. 加入0.5ml JC-1染色工作液,，顛倒數(shù)次混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育,。

c. 在孵育期間,，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入4ml蒸餾水的比例，配制適量的JC-1 Buffer(1×),，并放置于冰浴。

d. 37℃孵育結(jié)束后,， 4℃ 600g離心3～4min,，沉淀細胞。棄上清,，注意盡量不要吸除細胞,。

f. 再用JC-1 Buffer(1×)重懸后,，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析,。

4,、對于貼壁細胞：

注意：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測,，應先收集細胞,，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。

a.吸除6孔板培養(yǎng)液,，根據(jù)具體實驗如有必要可以用PBS或其它適當溶液洗滌細胞一次,，加入1ml細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅,。

b. 加入1ml JC-1染色工作液,，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育,。

c. 在孵育期間,，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入蒸餾水的比例，配制適量的JC-1 Buffer(1×),，并放置于冰浴,。

d. 37℃孵育結(jié)束后， 吸除上清,，用JC-1 Buffer(1×)洗滌2次,。

e. 加入2ml細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅,。

f. 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察,。

5、對于純化的線粒體：

a. 把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀釋5倍,。

b. 0.9ml 5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1ml總蛋白量為10～100μg純化的線粒體,。

c. 用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描，激發(fā)波長為485nm,，發(fā)射波長為590nm,。如果使用熒光酶標儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為485nm時,，可以在475～520nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長,。另外，也可以參考下面步驟6中的波長設(shè)置進行熒光檢測,。

d. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6,。

6、熒光觀測和結(jié)果分析：

檢測JC-1單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm,，發(fā)射光設(shè)置為530nm,；檢測JC-1聚合物時,，可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm，發(fā)射光設(shè)置為590nm,。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常,，細胞的狀態(tài)也比較正常。

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)注意事項
1,，JC-1（200×）在4℃,、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi),，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用,。

2，請勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×）,，本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩沖液（5×）,。

3，如JC-1 Buffer(5×)中有沉淀,，必須全部溶解后才能使用,，為促進溶解可以在37℃加熱。 JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測,。在檢測前需冰浴保存,。

4，應避免反復凍融,。不可先配制JC-1 Buffer(1×)再加入JC-1 Stain(200×),，否則導致JC-1很難充分溶解，嚴重影響后續(xù)的檢測,?？梢?0～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用.

5，裝載完JC-1后用JC-1 Buffer(1×)洗滌時,，盡量使JC-1 Buffer(1×)保持4℃左右,，此時的洗滌效果較好。

6,，CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑,，有毒，請注意小心防護,。

 7,，為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。