ELISA實驗操作篇之：試劑,，標本,，操作步驟對結(jié)果的影響

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 因其操作簡單，靈敏度高,，特異性好,，經(jīng)濟安全等特點而在研究上廣泛應(yīng)用，但是由于其操作步驟復雜,，一般包括試劑準備,，樣本收集，加樣,，溫育,，洗滌，顯色,，比色,，結(jié)果判定等，其中任何一項操作不當都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生很大影響,。因此,，必須加強ELISA檢測的全面質(zhì)量控制，保證其結(jié)果的準確可靠,。

1 試劑

的試劑是保證檢驗質(zhì)量的基礎(chǔ),。從4℃冰箱取出的試劑必須放置室溫20～30 min 后再啟用，否則水化層的形成可能影響試劑的原始濃度及試劑中溶質(zhì)分子的均勻分布,。未用完的試劑和質(zhì)控品應(yīng)密封并及時放回冰箱保存,。根據(jù)蛋白質(zhì)在冷凍過程中出現(xiàn)蛋白分子分布改變的特點，試劑正式啟用前應(yīng)充分混勻,。所用蒸餾水,、去離子水和自行配制的緩沖液等，都必須調(diào)整其pH 值和離子強度等。不同批次的試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量*一致,，因此必須選擇和訂購長批號的試劑,，并保證保存條件，嚴格執(zhí)行這一標準可以避免試劑批號改變而重建質(zhì)控體系及重新評估試劑的復雜過程,，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性,。

2 標本

患者標本中有可能含有干擾試驗的免疫物質(zhì)，導致假陽性或假陰性的結(jié)果,，干擾因素一般可分為兩類,，即內(nèi)源性和外源性干擾因素。內(nèi)源性干擾因素一般包括類風濕因子,、補體,、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體及某些自身抗體等,，避免內(nèi)源性干擾因素主要通過選擇合適的試劑,；外源性干擾因素包括標本溶血、標本被細菌污染,、標本貯存時間過長及標本凝固等,。要注意避免標本出現(xiàn)嚴重溶血，標本中血紅蛋白中含有血紅素基因,，其具有類過氧化物的活性,，因此，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標記的ELISA測定試驗中,，容易在溫育過程中吸附于固相,，從而與加入的底物反應(yīng)顯色。標本在低溫下保存時間過長,，IgG可聚合成多聚體,，在間接法ELISA測定中會導致本底加深，甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果,。通常血清標本可在2～8℃保存1 周,，冷凍保存時間會更長。血清標本應(yīng)充分離心,，否則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結(jié)果,。冷凍保存標本避免反復凍融，標本的反復凍融會因其所產(chǎn)生的機械剪切力對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用,，使抗體效價下降從而引起假陰性結(jié)果,。標本的采集及分離要注意盡量避免細菌的污染。此外,，標本在凍存時會因蛋白質(zhì)局部濃縮分布不均,，因此重新溶解的標本必須混勻,，但不要劇烈振蕩和反復顛倒。

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3 操作因素

3.1 加樣　

加樣器是一種比較精密的工具,，其在長時間使用時會因機械磨損或推動桿內(nèi)附著的血痂等原因造成加樣不準,，因此必須定期對加液器進行維護和校準。每次加不同的標本均需更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染,；加樣速度不可太快，以免將標本加在孔壁上部,，并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡,，加樣時還應(yīng)注意操作時差對結(jié)果的影響，尤其對競爭法檢測結(jié)果影響更大,。因此建議在加酶結(jié)合物和底物時用多道加液器,，或者雙人同時加樣以減少操作時差對結(jié)果的影響，另外有些項目在檢測前需要稀釋以減少非特異性反應(yīng),。稀釋的方式非常重要，*方式是采用振蕩器混勻,，不可隨意改變混勻方式,。

3.2 溫育

3.2.1溫育的溫度：育常采用的溫度有43 、37℃,、室溫或4℃等,。37℃是實驗室中常用的溫育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的zui適反應(yīng)溫度,?？乖贵w反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1～2 h 產(chǎn)物的生成可達，為加速反應(yīng),，可在一定范圍內(nèi)提高反應(yīng)的溫度并在反應(yīng)過程中連續(xù)振蕩來增加抗原抗體接觸的概率,。抗原抗體反應(yīng)在4℃更為*,，形成的產(chǎn)物更多,、更穩(wěn)定，但因所需時間太長,，在ELISA檢測中一般不予采用,。

3.2.2溫育的方式：溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法,。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（即“邊緣效應(yīng)”）,?？蓪?/span>ELISA板置于水浴箱中，板底應(yīng)貼著水面,，使溫度迅速平衡,，為避免蒸發(fā)，可用塑料貼封紙覆蓋板孔,。若用溫箱,，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等）,，在盒底墊濕的紗布,，zui后將ELISA板放在濕紗布上。溫育過程中每塊反應(yīng)板不能重疊放置,，防止溫度擴散的不均勻性,。

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