明膠酶譜法電泳試劑盒

1. 簡介：
基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌,，活化后能夠降解細胞外基質(zhì)的膠原蛋白,，又稱膠原酶。通過影響細胞外基質(zhì),，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程,，并參與炎癥、腫瘤,、心血管,、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程,，其在研究診斷和治療中的意義日益受到重視,。
 
2. 檢測原理：
本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性,。Zymography 是一種廣為使用的,、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達1 nM,，高于ELISA方法,，其基本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳,，電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應Buffer 孵育,，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染,，形成深色背景,，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,，因而不被染色而形成透亮區(qū)域,，從而能同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性,。本試劑盒提供MMP-2,、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩沖液，可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2,、MMP-9 酶譜及活性,，檢測靈敏度~1nM。試劑盒可進行50次標準小膠檢測,，如果小膠加樣孔為10~15個,，則總計可檢測500~750個樣品。
 
3. 檢測目的:
本試劑盒用于檢測MMP-2,、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM）,。
 
4.  試劑盒組成與儲存：
A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, −20 ºC；
B. 10 × Substrate G, 50 ml, −20 ºC,；
C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋,；
D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；
E. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液, 4 ºC,。
 
5.檢測步驟：
5.1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%,。按照標準程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化,，并90 ºC 加熱5分鐘,。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍,，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合,。
5.2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),，混合后直接上樣。切勿加熱變性,，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液,。可通過預試驗確定加樣量,，使用普通蛋白預染Marker 即可,。
陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠,、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣,。
注：因為全血成分復雜,MMP活性較低,，好的方法是將全血中白細胞進行分離做陽性對照
5.3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel,。溴酚藍跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳,。
5.4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠,，放入容器內(nèi),。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠,，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液,。
5.5 孵育：倒掉Buffer A,。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時,。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示,。如MMP 活性低，應延長孵育時間為10小時或過夜,。
5.6 顯色：倒掉Buffer B,，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液（操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染,，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域,。
透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性,。陽性對照將在66~72 (MMP-2),、92 (MMP-9),、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶,。
5.7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描,。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑,。解決辦法：可用非透射光掃描,，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設置為黑色,。MMP 條帶則為白色,，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中常見的格式。

注意事項：
1.制備聚丙烯酰胺時應注意排除氣泡,。
2.明膠酶譜的活性受鈣離子,，鋅離子，和PH值等因素的影響,，因此緩沖液配制應嚴格準確,，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好,。
3.用大梳子
4.孵育液的PH在7.5-7.6,，復性的TRITON時間長了會有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的,。
5.孵育的37度不要在CO2培養(yǎng)箱中,，因為會改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可,。
6.明膠要4度保存,，配好后1周內(nèi)使用

凝膠制備：
1.玻璃板對齊后放入夾中，垂直卡緊,，加滿水檢漏,。
2.配10%分離膠，APS和TEMED作用為促凝,，后灌膠前加,。若板不漏水，則將水倒出,，并用吸水紙洗凈后灌膠,，灌至大約3/4處，上面加滿水壓平,。
3.配濃縮膠,，同樣地，APS和TEMED后加,，分離膠灌入約30min后觀察小燒杯中剩余分離膠是否已凝,，同時仔細觀察可見玻板水和膠間有一條折線,，說明膠已凝固。
4.將上面的水倒去,，吸水紙洗凈,，灌入濃縮膠，灌滿,，注意一定不要有氣泡,，然后將梳子插入，注意保持水平,，約30min后凝固可用,。
5.拔梳子在電泳緩沖液中拔，加樣孔用小針筒沖洗干凈再上樣,，注意上樣時勿使樣品逸至鄰孔,，樣品混勻時要輕，不要產(chǎn)生氣泡,，否則加樣時易導致逸出而使結(jié)果不準確,。

明膠酶譜法電泳試劑盒