基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)明膠酶譜法(zymography)電泳分析試劑盒

上海信帆生物供應(yīng)明膠酶譜法試劑盒,，可檢測(cè)MMP2和MMP9的活性，檢測(cè)樣本適用于血清,，細(xì)胞,，細(xì)胞培養(yǎng)液等，歡迎大家訂購(gòu),！

明膠酶譜法試劑盒

描述：基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無(wú)活性的酶原形式分泌,，活化后能夠降解 細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白，又稱膠原酶,。通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì),，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生,、組 織重塑等過(guò)程,，并參與炎癥、腫瘤,、心血管,、神經(jīng)等許多疾病過(guò)程。血漿與組織中的 MMP-2,、MMP-9 參與各種生理與病理過(guò)程,，其在研究診斷和治療中的意義日益受到重視。

本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測(cè) MMP-2,、MMP-9  活性,。Zymography  是一種廣為使用的、基 于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法,，其靈敏度可達(dá) 1 nM,，高于 ELISA 方法 2，其 基 本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠,，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電 泳,， 電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng) Buffer 孵育，凝膠染色與脫色,。凝膠中由于含底物蛋白而被深 染,，形 成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置,，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,，因而不被染色 而形成透 亮區(qū)域，從而能同時(shí)指示 MMP-2,、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性,。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)明膠酶譜法電泳分析試劑盒

本試劑盒提供MMP-2,、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液，可檢測(cè)少至 0.1~0.5 µl 血液中的 MMP-2,、MMP- 9 酶譜及活性,，檢 測(cè)靈敏度~1 nM。試劑盒可進(jìn)行 50 次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè),，如果小膠加樣孔為 10~15個(gè),，則總計(jì)可檢測(cè) 500~750 個(gè)樣品。

檢測(cè)步驟：

1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠：推薦分離膠濃度為 8%,。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備 SDS- PAGE 凝膠,。將 10 × substrate G 融化，并 90 ºC 加熱 5 分鐘,。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍,，混勻后加入過(guò)硫酸銨和 TEMED，等待凝膠聚合,。

2. 待測(cè)樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),，混合后直接上樣。切勿加熱變性,，并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液,。可通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量,，使用普通蛋白預(yù)染  Marker   即可,。陽(yáng) 性對(duì)照(可選步驟)：可取人、小鼠,、大鼠或兔 100µl 全血與 100µl 2 × SDS-PAGE non-

reducing buffer 等體積混合,，取 5-15µl 上樣。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)明膠酶譜法(zymography)電泳分析試劑盒

3. 低電流恒流電泳,，每一塊小膠電流為 20    mA/gel,。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

4. 洗滌凝膠：取出凝膠,，去除濃縮膠,，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠,，然后加入  10    ml

1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘,。中間換液,。

5.  孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),，室溫或 37ºC 孵育 1~5 小時(shí),。陽(yáng)性 對(duì) 照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小時(shí)即可顯示,。如 MMP 活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為 10 小時(shí)或 過(guò)一夜,。

6.  顯色：倒掉 Buffer B,，加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見(jiàn) SDS-PAGE 凝 膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書(shū)）。凝膠的大部分區(qū)域被深染,，在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區(qū)域,。透明區(qū)域的位置和范圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性,。陽(yáng) 性對(duì)照將在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9),、130 (proMMP-9),、225 (proMMP-9) kDa 位置出現(xiàn)透 明條帶。

7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描,。雖然 MMP 條帶透明,，但凝膠背景并非真正全黑。解決 辦法：可用非透射光掃描,，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,，并盡量設(shè)置為黑 色。MMP 條帶則為白色,，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見(jiàn)的格式,。

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