細(xì)胞表面糖基化是腫瘤轉(zhuǎn)為惡性癌癥的一個標(biāo)志,。特定蛋白質(zhì)的糖基化會影響其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和表達(dá)水平,。細(xì)胞表面蛋白或脂質(zhì)的唾液酸聚糖化通過多種機(jī)制抑制免疫激活并充當(dāng)糖免疫檢查點(diǎn)。其中唾液酸聚糖與唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素Siglec（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin）的相互作用,，近期引起了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注,。
Carolyn R. Bertozzi和K. Barry Sharpless獲得了2022年諾貝爾化學(xué)獎，以表彰他們在發(fā)展點(diǎn)擊化學(xué)和生物正交化學(xué)方面的貢獻(xiàn),。他們利用點(diǎn)擊化學(xué)開發(fā)了一些針對糖基化的靶向藥物,，在研究中他們都用了活細(xì)胞實(shí)時成像系統(tǒng)Incucyte®！
2022年諾貝爾化學(xué)獎Carolyn R. Bertozzi
靶向降解唾液酸聚糖【1】
抑制型Siglec與PD-1類似,，其胞內(nèi)端含有免疫受體酪氨酸抑制結(jié)構(gòu)域（ITIM）,，能夠募集磷酸水解酶SHP1/2。研究表明,，腫瘤細(xì)胞表面蛋白或脂質(zhì)的唾液酸聚糖化通過唾液酸聚糖與Siglec信號通路發(fā)揮免疫抑制功能,，而唾液酸酶可以清除這些唾液酸聚糖?；诖?，研究者利用生物正交反應(yīng)構(gòu)建了以腫瘤特異性的方式靶向降解唾液酸聚糖的生物制品——曲妥珠單抗（靶向HER2陽性腫瘤）-唾液酸酶偶聯(lián)物T-Sia 2（下圖d）。T-Sia 2抑制腫瘤生長,，增強(qiáng)免疫細(xì)胞浸潤,，并延長曲妥珠單抗抵抗小鼠的生存周期。
文章使用Incucyte®檢測曲妥珠單抗與唾液酸酶之間連接子（Linker）的穩(wěn)定性,。研究者將熒光素AF647標(biāo)記連接子（oxime和HIPS）-抗體的偶聯(lián)物（下圖a）,，加入到HER2陽性的細(xì)胞培養(yǎng)體系里，并在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行連續(xù)4天的實(shí)時成像,。通過檢測并定量細(xì)胞上偶聯(lián)物的總熒光強(qiáng)度隨時間的改變,，定量結(jié)果可以體現(xiàn)該偶聯(lián)物隨時間的內(nèi)化、降解（圖c）和長時程穩(wěn)定性（圖d和e）,。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIPS-曲妥珠單抗偶聯(lián)物更穩(wěn)定,。
a. AF647標(biāo)記兩種連接子-抗體的偶聯(lián)物，與人血漿在37度孵育兩天后trastuzumab-HIPS的水平更高，與HCC-1954細(xì)胞孵育1h后,，換成正常培養(yǎng)基,，trastuzumab-HIPS內(nèi)化幅度更高，之后均被酶解隨時間熒光信號降低（圖c）,，如在培養(yǎng)基內(nèi)加入蛋白酶抑制劑來抑制酶解,，trastuzumab-HIPS信號可以保持長時程穩(wěn)定（圖d），如孵育后固定兩種耦聯(lián)物信號均可保持長時程穩(wěn)定（圖e）,。
Incucyte®成像組件就置于培養(yǎng)箱內(nèi),，想拍攝多久就拍攝多久。
2022年諾貝爾化學(xué)獎K. Barry Sharpless
靶向降解Siglec-7/9【2】
Siglec-7/9在腫瘤浸潤的髓系細(xì)胞上表達(dá)水平很高,，雖然T細(xì)胞內(nèi)Siglec的轉(zhuǎn)錄本只是基礎(chǔ)水平,，但它可以從腫瘤微環(huán)境內(nèi)發(fā)生相互作用的髓系細(xì)胞上通過胞吞作用獲取Siglec-7/9。后者使T細(xì)胞受體TCR相關(guān)信號通路去磷酸化,，從而抑制T細(xì)胞功能,。使用氟化硫交換（SuFEx）點(diǎn)擊化學(xué)，研究者開發(fā)了可以與Siglec-7/9以高特異性,、高親和力結(jié)合的配體,，并在該配體的基礎(chǔ)上構(gòu)建了Siglec-7/9 的降解劑——Sig7/9de。該降解劑借助細(xì)胞膜上的甘露糖-6-磷酸受體（M6PR）將Sigle內(nèi)化到溶酶體內(nèi),，以不可再循環(huán)的方式被降解（下圖g）,。Western Blot和流式檢測結(jié)果表明Sig7/9de可以誘導(dǎo)T細(xì)胞和髓系細(xì)胞膜上Siglec高效的降解。
野生型（EV P14）T細(xì)胞對B16-GP33腫瘤細(xì)胞具有顯著的殺傷作用,，Siglec-7/9均高表達(dá)T細(xì)胞（Siglec-7/9+ P14）的殺傷作用減弱,，如在殺傷體系中加入Sig7/9de，其對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力恢復(fù)（下圖h）,。
g. Sig7/9de降解試劑作用模式圖,；h. B16-GP33腫瘤細(xì)胞表達(dá)GFP，加入不同處理的P14 T細(xì)胞,，利用Incucyte® 間隔3h實(shí)時成像檢測48h,，以各組GFP陽性靶細(xì)胞數(shù)量與單靶細(xì)胞組細(xì)胞數(shù)的比值來定量各時間點(diǎn)T細(xì)胞的殺傷作用。
實(shí)時定量曲線直觀顯示效應(yīng)細(xì)胞什么時間點(diǎn)開始?xì)屑?xì)胞,，以及各組T細(xì)胞殺傷速度和強(qiáng)度的差異，定量結(jié)果的error Bar值很小,，說明Incucyte®群體定量的重復(fù)性很好,。后兩篇文章還用賽多利斯的另一款產(chǎn)品Octet®非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)檢測設(shè)計(jì)的生物藥物和靶點(diǎn)的親和力。
Incucyte®有什么優(yōu)點(diǎn)呢,？
培養(yǎng)箱內(nèi)自動進(jìn)行長達(dá)數(shù)周的連續(xù)觀察,，周末節(jié)假日也在采集數(shù)據(jù)，減少人力，提高實(shí)驗(yàn)效率
組間樣本連續(xù)成像時樣品板不動,，不影響效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的相互作用,，聚焦穩(wěn)定，結(jié)果更客觀
多個板位可分別獨(dú)立設(shè)置檢測程序,，兼容各種多孔板和培養(yǎng)皿,，通量高
具有劃痕、腫瘤球,、類器官,，趨化、血管生成等多個軟件模塊,，提高分析效率
向?qū)杰浖O(shè)置,，簡化成像、數(shù)據(jù)分析和圖片,、視頻導(dǎo)出流程,，是真正可以用起來的設(shè)備
大于60種優(yōu)化過的詳盡的Protocol，提高實(shí)驗(yàn)效率
用戶群廣,，應(yīng)用文獻(xiàn)數(shù)大于18,000篇,，認(rèn)可度高
只要放好您的細(xì)胞，其他交給Incucyte®吧,！跟隨諾貝爾獎獲得者的腳步用Incucyte®發(fā)好文章吧,！
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Incucyte®長時程活細(xì)胞成像系統(tǒng)應(yīng)用文集
-參考文獻(xiàn)-
【1】Gray, M.A., Stanczak, M.A., Mantuano, N.R. et al. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nat Chem Bol 16, 1376–1384 (2020)
【2】Wang C, Hou Y, Zak J, Zheng Q, McCord KA, Wu M, Zhang D, Chung S, Shi Y, Ye J, Zhao Y, Hajjar S, Wilson IA, Paulson JC, Teijaro JR, Zhou X, Sharpless KB, Macauley MS, Wu P. Reshaping the tumor microenvironment by degrading glycoimmune checkpoints Siglec-7 and -9. bioRxiv [Preprint]. 2024 Oct 12:2024.10.11.617879. doi: 10.1101/2024.10.11.617879. PMID: 39416090; PMCID: PMC11483058.
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