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Octet垂釣技術(shù)：中藥活性分子篩選新典范（文末福利）
中醫(yī)藥的作用機(jī)制是多層面且復(fù)雜的,，涉及多種因素和機(jī)制,。當(dāng)前研究面臨的一大挑戰(zhàn)就是發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)中醫(yī)藥在體內(nèi)作用靶點(diǎn)以及對應(yīng)的活性組分，從而闡釋其藥效作用的分子機(jī)制,，為中醫(yī)藥作用機(jī)理提供了現(xiàn)代科學(xué)的闡釋,。鑒定小分子藥物作用的靶蛋白對于理解小分子藥物的作用機(jī)制和應(yīng)用有著至關(guān)重要的作用，這不僅有助于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)小分子藥物的脫靶靶標(biāo),、副作用,，還能深入探究靶蛋白參與的生物學(xué)功能。
長期以來,，由于中藥成分的復(fù)雜性和微量化,，對其靶點(diǎn)和分子機(jī)制的研究一直沒有取得重大進(jìn)展，對檢測和分析方法的靈敏度,、粗樣品和有機(jī)溶劑的耐受度要求非常高,。為突破這一研究瓶頸，北京大學(xué)的屠鵬飛課題組聯(lián)合浙江工業(yè)大學(xué)顏繼忠課題組發(fā)表最新的文章[1]以參芪降糖顆粒(SJG)為例提出了一種結(jié)合傳統(tǒng)中藥微球和生物層干涉測量（BLI）技術(shù)的新方法,，用于發(fā)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中的關(guān)鍵藥物靶點(diǎn),。
參芪降糖顆粒(SJG) 是臨床上常用的治療2型糖尿病及其并發(fā)癥，如糖尿病腎病(DN)的中藥制劑,。由人參,、黃芪、地黃等11種草藥組成,，但其干預(yù)DN的生物學(xué)靶點(diǎn)和機(jī)理仍不清楚,。
圖1. 基于傳統(tǒng)中藥微球（TCM-MPs）的靶點(diǎn)捕釣策略：
①TCM-MPs的構(gòu)建
②TCM-MPs富集特異靶點(diǎn)
③用Octet® 進(jìn)一步垂釣相關(guān)化合物，并進(jìn)行驗(yàn)證
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構(gòu)建TCM-MPs和靶蛋白富集
——以“粗”釣“粗”
這些微球由四層結(jié)構(gòu)組成：Fe3O4磁性納米層,、油酸修飾層,、光親和基團(tuán)（TAD）層和活性小分子層。TAD在紫外光下產(chǎn)生高活性的卡賓,，可以非特異的固化藥物分子,。研究人員構(gòu)建了基于SJG的TCM-MPs被用于捕釣人腎小球系膜細(xì)胞（HMCs）裂解物中相關(guān)蛋白，利用TCM-MPs與細(xì)胞裂解液共孵育,，通過UHPLC-Q/TOF-MS/MS分析篩選目標(biāo)蛋白,，篩選出了28個(gè)差異蛋白?；谏镄畔W(xué)分析,，研究人員選擇了GNAS作為關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖2），該蛋白參與胰島素分泌和cAMP信號通路,。
圖2. 活性成分靶蛋白鑒定
2
基于Octet® 非標(biāo)記分子互作分析系統(tǒng)垂釣GNAS相互作用的活性小分子
——以“單”釣“粗”
研究者建立了一種基于Octet® 的垂釣技術(shù),，其無流路設(shè)計(jì)允許多次垂釣,，以富集低豐度且結(jié)合能力較弱的小分子,，從而提升垂釣的成功率,。研究人員將GNAS蛋白固化至Octet® SA傳感器表面，再與中藥提取物結(jié)合,，雖然中藥提取物是粗樣品成分復(fù)雜,，且含有高濃度的DMSO，但是BLI技術(shù)對溶劑不敏感從而避免了傳統(tǒng)流路方法導(dǎo)致的系統(tǒng)堵塞和有機(jī)溶劑高折光率導(dǎo)致的假陽性問題,，確保獲得高靈敏度且準(zhǔn)確的結(jié)果,。隨后提取物被解離至緩沖液中，將解離液使用UHPLC-Q/TOF-MS/MS分析GNAS垂釣出的小分子,。通過垂釣組與對照組的相對含量變化篩選26個(gè)小分子可能與GNAS有相互作用,。
圖3. Octet® 垂釣結(jié)果：GNAS結(jié)合較強(qiáng)的化合物以及相對含量比值
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活性小分子的驗(yàn)證
Octet® 驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)化合物顯示出強(qiáng)結(jié)合活性，均是是SJG的主要成分,。其中,，黃芪中的Formononetin、高麗參的三七皂苷Ft1和人參皂苷中的甲素人參F2為“君”,、地黃中的Catapol為“臣”,，五味子中的五味子素A和茜草中的沒食子酸為“佐使”，符合中醫(yī)配伍“君臣佐使”原則,。
圖4. Octet® 驗(yàn)證小分子和GNAS的結(jié)合
參芪降糖顆粒（SJG）用于糖尿病腎病的治療,，因此人腎小球系膜細(xì)胞（HMCs）是理想的細(xì)胞模型用于進(jìn)一步驗(yàn)證上述的小分子藥物活性，通過HMCs驗(yàn)證了垂釣出的活性成分對cAMP通路的影響,，SJG及7種有效成分對高糖誘導(dǎo)的HMCs有保護(hù)作用,。
圖5. 基于cAMP途徑驗(yàn)證活性化合物對GNAS下游通路的影響
綜上所述，通過結(jié)合TCM-MPs富集策略和Octet® 垂釣技術(shù),，研究者能夠有效地篩選出與GNAS直接相互作用的活性化合物,，并驗(yàn)證了這些化合物通過激活cAMP通路的潛在藥理作用。該垂釣策略有望應(yīng)用于篩選與各種復(fù)雜系統(tǒng)作用相關(guān)的靶蛋白和關(guān)鍵靶蛋白中的生物活性成分,，為基于靶標(biāo)的藥物發(fā)現(xiàn)提供有效的信息,，對于中藥復(fù)雜體系的藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)具有重要意義。
與傳統(tǒng)方法相比,，使用Octet® 進(jìn)行垂釣的優(yōu)勢在于：
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提供多種傳感器固化已知分子,，并且盡可能減少非特異性吸附
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通過垂釣的BLI信號，可以判斷是否有物質(zhì)釣出
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可以自動化多次循環(huán),，在同一個(gè)孔里富集洗脫樣品
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由于Octet®采用非標(biāo)記實(shí)時(shí)技術(shù),，可以對純化后的活性分子結(jié)合能力進(jìn)行更可準(zhǔn)確的驗(yàn)證
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-參考文獻(xiàn)-
[1] Zhang H, et al. Discovery of drug targets based on traditional Chinese medicine microspheres (TCM-MPs) fishing strategy combined with bio-layer interferometry (BLI) technology. Anal Chim Acta. 2024 May 29;1305:342542.