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2023年諾貝爾醫(yī)學獎告訴您：親和力測定很重要,！

閱讀：439 發(fā)布時間：2023-10-18

北京時間10月2日，備受矚目的“2023年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎”被授予科學家Drew Weissman和Katalin Karikó,，以表彰他們在mRNA疫苗領域的杰出貢獻,。

在新冠爆發(fā)之前，mRNA疫苗對大多數(shù)人來說還是一個相對陌生的概念。這種疫苗是通過編碼病原體某個蛋白組分的基因序列的mRNA，在體內(nèi)表達成蛋白質(zhì)進行抗原呈遞,，并具有自佐劑作用。相比其他疫苗,，mRNA疫苗具有“即插即用”的優(yōu)勢,，只需知道病原體結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列就可以進行大規(guī)模生產(chǎn)。此外,，它還能在體內(nèi)引發(fā)強烈的免疫應答,，并產(chǎn)生高滴度的抗體。接下來,，讓我們一起看看兩位諾獎得主在2018年發(fā)表的一篇文章^[1],，以更好的理解mRNA疫苗到底有多牛！

這篇文章對mRNA疫苗的研究非常全面:

涉及了流感疫苗,、HIV疫苗和寨卡疫苗
包含小鼠和靈長類動物實驗
從體液應答和細胞免疫應答等方面對疫苗進行評估

m1Ψ-mRNA-LNP

可長時間有效地生產(chǎn)蛋白質(zhì)

1-甲基假尿苷（m1Ψ）修飾mRNA,，可以防止mRNA疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生炎癥反應,，同時還能提高蛋白質(zhì)的表達效率,。這是兩位諾貝爾獎獲得者對mRNA疫苗做出的重要改進之一。接下來,，我們來看一下這種改進帶來的實驗結(jié)果：

圖1. 相對與未修飾的mRNA-LNP，編碼熒光素酶（Luc）的m1Ψ-mRNA-LNP的翻譯水平較高,，并可以維持13天的蛋白質(zhì)表達

小鼠細胞免疫評估

圖2. 相比于對照mRNA,、滅活流感病毒疫苗以及未修飾mRNA疫苗，m1Ψ修飾的HA mRNA疫苗（編碼流感病毒HA蛋白）能產(chǎn)生更強的抗原特異性CD4+細胞免疫應答

對于CD8+細胞免疫應答結(jié)果也類似,。HA mRNA疫苗免疫后,，總脾GC（生發(fā)中心）B細胞大幅增加（約8-59倍），單次免疫后8天脾漿細胞的數(shù)量也增加,，并顯著增加了脾臟中Tfh細胞（濾泡輔助性T細胞）總數(shù)

小鼠抗體評估

流感疫苗誘導的抗體滴度主要通過血凝抑制（HAI）測定法來測量,。在這種方法種，1:40的體外HAI滴度被認為可以保護人類免受流感感染,。在接種HA mRNA疫苗單次免疫后,，在2周觀察到640的HAI滴度，在4周時這個數(shù)值增加到2000,。

圖3. 在體液免疫應答方面,，mRNA疫苗所產(chǎn)生的抗體滴度是最高的，并且能持續(xù)至少一年不降低

在靈長類動物實驗中,，編碼寨卡病毒prM-E蛋白的mRNA疫苗,，也產(chǎn)生了持續(xù)一年的高滴度抗體,。

抗體親和力測定

由于Tfh細胞促進親和力成熟，小鼠單次免疫HA mRNA疫苗后多克隆抗體的親和力是重要表征模型,。而高滴度不一定意味著高親和力,，所以在這篇文章中，作者使用賽多利斯Octet® 非標記分子互作系統(tǒng)來檢測血清中多克隆抗體的親和力,！首先使用AMC傳感器（anti-mouse IgG）固化血清中的抗體,，與31.25nM的HA進行結(jié)合解離，并用pH2.5的甘氨酸進行再生,，然后用1:1模型擬合獲得KD值（平衡解離常數(shù)）,。

在接種疫苗2周后，產(chǎn)生的抗體親和力隨著接種時間增加而增加,，4周的時候KD值為362pM,8周的時候為6pM,。相比之下，使用未修飾的mRNA或滅活的流感病毒顆粒免疫的小鼠中抗體的親和力低得多,。Tfh細胞反應通過體細胞超突變驅(qū)動親和力成熟,；但是需要進一步對Ig可變基因進行測序，并檢測純化的單克隆抗體的親和力,。

圖4. Octet® 測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)：mRNA疫苗免疫時間越長,，抗體親和力越高；縱坐標為KD值（單位nM）

圖5. 相對于未修飾的mRNA疫苗（中）和滅活疫苗（右）,，修飾的mRNA疫苗（左）的親和力最高

高親和力抗體的產(chǎn)生是中和多種病原體的基礎,。這項研究證明了m1Ψ-mRNA-LNP疫苗能夠產(chǎn)生針對流感病毒、ZIKV和HIV-1的高滴度,、高親和力和持續(xù)性中和抗體的能力,。

輝瑞和BioNtech的
mRNA疫苗（BNT162b2）

卡里科博士作為BioNTech公司的高級副總裁，在新冠爆發(fā)后,，引領了新冠mRNA疫苗的問世,。

它是一個大規(guī)模使用的新冠mRNA疫苗。在其遞交給歐洲藥物管理局（EMA）的評估報告^[2]和發(fā)表的Nature研究性文章^[3]中均提到：

利用Octet® 非標記分子互作系統(tǒng)（BLI技術(shù)）來測定mRNA表達產(chǎn)物的結(jié)合活性,。通過生物傳感器分別固化ACE2和抗體,，與293T細胞中表達的不同濃度的S蛋白（疫苗表達產(chǎn)物）進行親和力測定。兩者的親和力均在nM級別,，符合正常S蛋白與受體及中和抗體的結(jié)合能力,，并以此作為疫苗功能確認的指標之一。

在其公布臨床前研究中可發(fā)現(xiàn),，該疫苗編碼的是S蛋白,，其中986/987位氨基酸殘基突變成了脯氨酸，與野生型S蛋白相比,，不會與細胞膜融合,，維持了融合前構(gòu)象,。該疫苗的表達產(chǎn)物保持了與受體ACE2以及一種RBD中和抗體的親和力。同時,，還同時設計了其他序列,，一起與BNT162b2平行比較，最終選擇了BNT162b2作為候選mRNA新冠疫苗,。

我們都知道,，從分子生物學的角度來看，RNA是一種非常不穩(wěn)定的分子,。然而,，通過幾十年的技術(shù)積累，科學家們成功的將RNA做成一類疫苗,，并在新冠疫情種拯救了數(shù)以千萬計的生命,。這也就是為什么這次諾貝爾醫(yī)學獎眾望所歸的原因吧。

你知道嗎,？連續(xù)四年的諾貝爾獎獲得者都曾使用Octet® 非標記分子互作系統(tǒng)進行研究,，并發(fā)表了文章：

2020-2022