黄色网站A级大片,亚洲无码A片在线视频

產品分類 品牌分類

分子垂釣最怕非特異性和低親和力,？Octet來救場！

閱讀：718 發(fā)布時間：2023-9-14

適配子（Aptamer）是對某個靶點分子有特異結合的DNA或RNA寡核苷酸,，因其分子識別能力在診斷和治療應用中具有巨大的潛力,。然而，高親和力和高特異性的核酸適配子往往不容易獲得,。適配子一般是通過SELEX方法從核酸庫中進行篩選,，這個方法依賴于將靶點分子固定在某個固相，再去釣取潛在與靶點結合的適配子,，但是固化有可能導致的空間位阻限制了靶點和適配子結合的自由度,。

背景與實驗設計

近期的一篇文章中，四川大學生命科學學院黃震組先將靶點生物素化,，然后將生物素靶點（HPV L1蛋白）和適配子在液相中混合形成適配子-靶點復合物,，再用偶聯(lián)鏈霉親和素的固相介質（包括磁珠和Octet® 傳感器）去抓取這種復合物，并進行洗脫鑒定,，這樣便成功克服了先固化靶點所帶來的不利影響,，使得適配體的篩選效率顯著提升，該方法被稱之為 Free Aptamer-ligand Interaction (FRARI)^[1],。

圖1. FRARI示意圖：通過多輪FRARI循環(huán),，富集和篩選到高親和力的適配子

本篇文章在篩選適配子過程中做了2個不同維度的比較：

SELEX, Octet® (BLI法，生物層干涉), 和MB (磁珠法)三種方法的比較,；

隨機生物素化靶點和定點生物素化靶點的比較：前者通過靶點蛋白的氨基隨機共價偶聯(lián)生物素,，后者通過Avi tag在N端進行定點生物素化，原則上后者可以更好地保持靶點的天然結構,。

Octet® 的實驗方法與結果

將生物素化靶點和DNA文庫室溫下孵育1小時,。然后，使用Octet® 的SA傳感器與混合物孵育50分鐘來捕獲形成的復合物,。用PBS洗滌兩次（一次600秒,，一次120秒）后，將捕獲的復合物傳感器用蛋白酶K（1.8μL,，20mg/mL）52°C中消化2小時,。接下來,，擴增、制備次輪文庫,，進行多輪篩選后測序鑒定,。

圖2. SELEX, MB, Octet® 三種方法比較（定點生物素化法）：SELEX 九輪富集的特異適配子豐度（a）遠遠低于FRARI方法，包括BLI（b）和MB（c）

對比發(fā)現(xiàn),，Octet® 法和MB法在進行6輪篩選后便能富集獲得特異性適配子,，而在經(jīng)過9輪篩選后，Octet® 法和MB法均實現(xiàn)了高豐度的特異性適配子富集,。并且基于FRARI的Octet® 法篩選出的幾個高親和力適配子與基于MB法篩選的結果是一致的,。更關鍵的是，Octet® 法豐度的區(qū)分度更好,，比如最高豐度的一個適配子（藍色）占絕大多數(shù)，隨后的實驗也證實該適配子具有更強的親和力,，說明Octet® 可以更好地區(qū)分特異性適配子的親和力,。

方法驗證

Octet® 篩選出的豐度較好的適配子（S4）親和力是否更強呢？作者將生物素化的適配子固化在鏈霉親和素（SA）傳感器上,，與靶點蛋白進行結合解離，以計算結合動力學參數(shù)。

圖3. Octet® 法篩選出的適配子與靶點親和力,，可見S4的親和力最高,，KD值達到幾十nM

隨后作者使用Octet® 法篩選的適配子成功建立了基于夾心法的HPV臨床診斷方法，實現(xiàn)了臨床樣品中HPV的檢測,，進一步證明這些適配子的強親和力和特異性,。

Octet® 傳感器不僅適合FRARI法，而且相對MB法,，Octet® 可以排除許多低親和力適配子,，這可能是因為BLI傳感器具有較少的表面積和非特異性結合。因此,，Octet® 為核酸適配體的選擇提供了高效率的篩選方法,。

最近廣西大學發(fā)表的一篇文章中，開發(fā)了一種便攜式,、獨立的核酸適配子傳感器用于檢測蝗蟲信息素4-乙烯基苯甲醚（4VA）,，以監(jiān)測蝗蟲種群動態(tài)，實現(xiàn)蝗災預警,。使用Octet® 的垂釣方法獲得了針對4VA的KD值為269.25±90.65nM的高親和力適配子,，并用此來建立傳感器檢測方法。