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?抗體發(fā)現(xiàn)是開發(fā)單克隆抗體藥物、雙特異抗體藥物,、ADC 藥物和Car-T細胞治療藥物的必經(jīng)之路。目前，單克隆抗體發(fā)現(xiàn)的技術主要有雜交瘤技術,、噬菌體展示技術和單B細胞篩選技術。其中單B細胞篩選技術由于其研發(fā)周期短而備受矚目,。

該技術將單細胞分離鑒定與分子生物學結合,，獲得單個B細胞抗體基因并進行體外克隆和表達，獲得的抗體保證了輕重鏈可變區(qū)的天然配對,；相較于傳統(tǒng)的抗體制備技術,，具有效率高、全人源、基因多樣性豐富,、細胞數(shù)量少,、周期短、適用于任意動物抗體篩選等優(yōu)點,。但是,，由于抗原特異性細胞的比例較低，需要借助高通量及高靈敏的分選系統(tǒng)對少量的特異性 B 細胞進行富集,。

近期,，Amgen提出了一種使用CellCellector 全自動無損細胞分離系統(tǒng)從用重組治療蛋白EGFR 免疫的Xeno Mouse R（XM）中分離單個抗原特異性原代B細胞的方法。這種方法為抗原特異性抗體的分離和驗證提供了一個快速,、高效和經(jīng)濟的平臺,。

整篇研究，思路清晰,，流程簡單,，解析如下：

1 使用CellCelector Flex全自動無損細胞分離系統(tǒng)分離EGFR特異性B細胞

從三只接種EGFR-ECD（EGFR的ECD結構域）的小鼠身上獲得了200 萬個CD138 陽性的抗體分泌細胞（antibody-secreting cells，ASCs）,，這些小鼠顯示出EGFR滴度,。CD138（Syndecan-1）的表達已被用于廣義地定義ASC 群體。

1,、我們將60,000個細胞加載到包含約60,000個納米孔/孔的六孔板（CellCelector特色耗材）中,，以實現(xiàn)平均每個納米孔一個細胞。

2,、將抗人IgG Fc 特異性beads,、抗人IgG連接的Alexa Fluor647（AF647）、生物素化的EGFR和AlexaFluor488（AF488）連接的鏈霉親和素的混合物與細胞進行孵育,。

3,、通過CellCelector的明場和熒光通道成像功能掃描了52,000個納米孔，以確定含有分泌抗體（AF647+）和與EGFR結合陽性（AF488+）的B細胞,。

4,、最終確定了1,189個含有ASCs（IgG-AF647陽性）的納米孔和238個含有EGFR特異性ASCs（AF488和AF647雙陽性）的納米孔，利用CellCelector導出94個EGFR陽性的ASCs用于IgG重鏈和輕鏈的分子回收（圖1）,。

圖1. 雙陽性細胞的代表性熒光和明場圖像,。

A) 647nm發(fā)射波長的熒光特異性圖像（紅色）；觀察到兩個鄰孔含有ASCs,；(B) 488nm發(fā)射波長的熒光特異性圖像（綠色）,，觀察到相鄰的一個孔含有EGFR特異性的ASC；(C)647和488nm通道的圖像疊加,；(D)用于挑選EGFR+ASC的明場圖像,；(E)從納米孔中挑取EGFR+ASC之前的明場圖像和(F) 從納米孔中挑取EGFR+ASC之后的明場圖像,。

CellCelector 的優(yōu)勢在于：

1、用于自動調(diào)整毛細管高度的SurePick™ 技術,，在挑選過程中對毛細管高度進行動態(tài)調(diào)整,，允許從高度不平或半固體表面進行高效的全自動挑選

2、用于高通量篩選的Nanowell 納米孔板技術,，每個納米板含有十萬到數(shù)百萬個納米孔,，實現(xiàn)更高通量的細胞分選

3、支持全板掃描,，每次挑取僅需20-30s,，實驗操作時間短，自動化程度高

4,、全流程存檔記錄及質(zhì)量控制,，完全自動化的質(zhì)量控制過程，包括揀選前后的圖像,、揀選/失敗報告和數(shù)據(jù)/圖像輸出

5、適用于貼壁細胞,，懸浮細胞或半固體培養(yǎng)基中的細胞,；單細胞，細胞團,，球體或菌落,；原代細胞或細胞系；活細胞或固定細胞

6,、一機全能,，集分選、成像和挑取為一體

2 通過iQue® 高通量流式細胞儀在細胞水平檢測抗體結合能力

通過RT-PCR進行IgG重鏈和輕鏈擴增并進行了測序,，成功克隆,、表達和純化了20個獨特的抗體序列。這20個序列被克隆到人IgG1同型的表達載體中,，瞬時轉染到293T細胞,，5天后收獲含有抗體的培養(yǎng)基上清，使用Octet® 對上清液進行定量分析,，確定其濃度在22至398mg/L之間,。使用iQue3® 高通量流式細胞儀測定20種表達抗體與CHO細胞上瞬時表達的EGFR的特異性結合（圖2A）

圖2. 20個表達的克隆的表征。

(A)通過流式細胞儀測定抗體與表達EGFR的CHO細胞的結合,；(B)用BLI測定抗體對可溶性EGFR的親和力,；(C)三個有代表性的親和力檢測結果圖顯示了與可溶性EGFR的高親和力（<1nM）、中等親和力（1-10nM）和無結合,。

iQue® 高通量流式的優(yōu)勢在于：

1,、氣泡分隔的連續(xù)采樣技術,，使流式細胞術進入高通量篩選(HTS)領域

2、最小樣本體積達到10uL,，支持384,、1536孔板采樣，96孔板只需5min

3,、ForeCyt軟件,、比起傳統(tǒng)流式更簡單的使用及維護，硬件配套軟件,，是高通量流式篩選必備儀器

3 Octet® 非標記分子互作系統(tǒng)從分子水平檢測抗體結合能力

通過Octet® 測定抗體對可溶性EGFR的親和力,。AHC傳感器固化抗體，然后與EGFR結合解離,，EGFR的濃度范圍為1.56nM至100nM,。結果分為3類：高親和力（<1nM）、中等親和力（1–10nM）,，與可溶性EGFR無結合（圖2B和C）,。流式結果和Octet®檢測結果一致。因此,，能夠確認來自原代B細胞的分離序列與天然EGFR細胞和可溶性EGFR蛋白有明顯結合,。

Octet®非標記分子互作系統(tǒng)的優(yōu)勢在于：

1、非標記Direct binding是趨勢,，結果更準確

2,、快速測定親和力，更加定量化地表征分子互作

3,、無洗滌步驟,，可測弱親和力（解離快）

4、寫入了美國藥典,，文章多,，認可度廣

5、萬金油技術,，可以用于檢測DNA,，小分子，蛋白質(zhì)等各種生物分子,；如這篇文章檢測的就是病毒顆粒樣品

6,、操作簡便，耗材及維護成本低

7,、高通量,，本文使用RH96，可以同時檢測96個樣品

總結

本研究通過CellCelector平臺快速高效的篩選和分離ASCs,，獲得陽性B細胞序列后,，結合iQue® 高通量流式細胞平臺以及Octet® 非標記分子互作系統(tǒng),，3-4周內(nèi)成功獲得抗原特異性抗體，為大家解析了如何利用賽多利斯新三劍客快速高效的進行高單B細胞篩選的典型流程,，為新型抗體藥物的發(fā)展指引了新的方向,。