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當(dāng)前位置：> 供求商機> 10907ES20-Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit
貨物所在地：上海上海市
更新時間：2025/1/19 21:00:07
訪問次數(shù)：262
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產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 儲存 | 價格（元） |
Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒 | 10907ES20 | 20T | -20℃ | 528.00 |
Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒 | 10907ES60 | 5×20T | -20℃ | 2378.00 |
產(chǎn)品描述
本試劑盒是利用拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase）高效快速連接DNA （脫氧和糖核酸）片段的原理進(jìn)一步研發(fā)而成，與傳統(tǒng)的T4連接酶相比,，具有以下優(yōu)勢：1）快速,，僅需1-5分鐘即可完成連接反應(yīng)。2）高效,，無自連現(xiàn)象,，陽性克隆率接近*，無需設(shè)置藍(lán)白斑篩選,；3）操作簡單,，從連接到涂板僅需15-20min。操作過程省去冰浴,、熱激和1h復(fù)蘇等,。4）可連接長達(dá)10kb目的產(chǎn)物。
產(chǎn)品用途
A尾PCR產(chǎn)物的快速克隆,。
克隆后PCR產(chǎn)物的快速測序【使用M13F/M13R引物】,。
產(chǎn)品組分
組分編號 | 組分名稱 | 產(chǎn)品貨號（規(guī)格） | |
10907ES20（20T） | 10907ES60（5×20T） | ||
10907-A | pESI-T vector (30ng/µl) | 20µl | 5×20µl |
10907-B | 1kb control insert(40ng/µl) | 5µl | 5×5µl |
10907-C | 10×Enhancer | 20µl | 5×20µl |
運輸和保存方法
冰袋運輸。-20°C保存,，避免反復(fù)凍融,。有效期一年。
注意事項
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。
使用方法
♣ Control DNA （脫氧核糖核酸）片段的克隆實驗
1）在無菌微量離心管中配制下列DNA溶液,，以10µl為例。
10 ´ Enhancer | 1µl |
1kb control insert (40ng/µl) | 1µl |
pESI-T vector (30ng/µl) | 1µl |
ddH2O | 7µl |
2）混勻上述體系,。于室溫（20-30℃）反應(yīng)5min。
【注】：連接反應(yīng)不可于冰上進(jìn)行,。反應(yīng)時間不要超過5min,，一般1-2min即可完成連接反應(yīng)，得到足夠的重組子,。
3）連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化或于-20℃保存,。
4）全量10ml加入100ml感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻,，室溫放置5min,。
【注1】：也可取5ml連接液，加入50ml感受態(tài)細(xì)胞中（加入體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10),。
【注2】：通常使用商品化的感受態(tài)細(xì)胞不需要冰浴和熱休克,、室溫放置5min便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子，如果感受態(tài)細(xì)胞效率較低時,，可以按照冰浴熱激的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行,。
5）加300-500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃180 rpm振蕩培養(yǎng)10min,。
6） 取200ml菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基）,，培養(yǎng)一個晚上（如果預(yù)計轉(zhuǎn)化子少，為得到較多克隆,，4000 rpm 離心1min,，吸棄掉部分上清，保留100ml,，輕彈懸浮菌體,，取全部菌液涂板）。
♣ 一般DNA（脫氧核糖核酸）片段的克隆實驗
所插入片段為含A尾產(chǎn)物,，利用常規(guī)Taq酶（Yeasen,，Cat#10101-10107），或熱啟動型Taq酶（Yeasen,，Cat#10110）,， 或長片段DNA聚合酶（Yeasen，Cat#10107ES62）擴增得到的產(chǎn)物如無非特異性條帶,、引物二聚體可直接進(jìn)行連接反應(yīng),。
否則建議膠回收后使用。
【注】：a、PCR產(chǎn)物不能磷酸化,。
b,、如擴增模板為質(zhì)粒，模板質(zhì)粒會在后續(xù)實驗中引起假陽性,，因此推薦PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后連接,。
1）按照下表配制連接體系（以10µl為例*）
10 ´ Enhancer | 1µl |
pESI-T vector(30ng/µl) | 1µl |
插入片段** | 0.5-8µl |
ddH2O | To 10µl |
【注】：* 可根據(jù)具體實驗情況按照上述比例調(diào)整反應(yīng)體系。
** 不同的插入片段所用量參考下表
插入片段大?。?/span>1kb） | *用量(ng) |
0.1-1kb | 20-50 ng |
1-2kb | 50-100 ng |
2-5kb | 100-200 ng |
2）混勻上述體系,。于室溫（20-30℃）反應(yīng)5min。
【注】：連接反應(yīng)不可于冰上進(jìn)行,。反應(yīng)時間不要超過5min,，一般1-2min即可完成連接反應(yīng)，得到足夠的重組子,。
3）全量10ml加入100ml感受態(tài)細(xì)胞,，輕輕混勻，室溫放置5min,。
【注1】：也可取5ml連接液,，加入50ml感受態(tài)細(xì)胞中（加入體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10)。
【注2】：通常使用商品化的感受態(tài)細(xì)胞不需要冰浴和熱休克,、室溫放置5min便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子,，如果感受態(tài)細(xì)胞效率較低時，可以按照冰浴熱激的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行,。
4）加300-500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素),，37℃180 rpm振蕩培養(yǎng)10min。
【注】：通常商品化的感受態(tài)細(xì)胞不超過2kb插入片段情況下,，10min復(fù)蘇可以得到足夠多轉(zhuǎn)化子,，如果感受態(tài)效率低或者插入片段長轉(zhuǎn)化子少的情況下可以提高復(fù)蘇時間到30-60min以得到更多的轉(zhuǎn)化子。
5） 取200ml菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基）,，培養(yǎng)一個晚上（如果預(yù)計轉(zhuǎn)化子少,，為得到較多克隆，4000 rpm 離心1min,，吸棄掉部分上清,，保留100ml，輕彈懸浮菌體,，取全部菌液涂板）,。
6）轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定
① 菌液PCR鑒定；
② 質(zhì)粒大小鑒定：挑取單克隆,，抽提質(zhì)粒后可根據(jù)質(zhì)粒大小進(jìn)行鑒定,。
③ 酶切鑒定：根據(jù)克隆實驗設(shè)計，選擇合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定。
④ 測序分析：可選測序引物序列如下
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：CAGGAAACAGCTATGACC
【注】：本制品陽性率相當(dāng)高,，一般情況下,，陽性克隆率接近*，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌,，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少）,，基本就是陽性克隆，因此插入片段不超過2-3kb的情況下可以不用鑒定直接挑1-2個菌去測序,。
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