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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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16816ESHieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)
| 參考價: | 面議 |
具體成交價以合同協(xié)議為準- 16816ES 產(chǎn)品型號
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問次數(shù)：249更新時間：2025-02-07 13:44:34
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產(chǎn)品簡介
| 供貨周期 | 兩周 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
|---|
產(chǎn)品介紹
Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 適用于對各種動物細胞進行基因定量表達分析（如cell line 化的貼壁細胞和懸浮細胞,、原代培養(yǎng)細胞,、各種干細胞、iPS 細胞等）,，無需提RNA,，可直接進行qPCR表達分析，用時短,，操作簡單,，出錯率低，最短只需1.5 h就可高效完成從模板制備到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及基因表達分析等步驟,。該產(chǎn)品為探針法細胞直擴RT-qPCR試劑盒的熒光定量qPCR模塊,，為補充試劑。
儲存條件
長期保存時請于-25~-15℃保存,，有效期1年,。
使用說明
一、裂解產(chǎn)物的制備
將試劑放置室溫下融化,，使用前上下顛倒，輕輕混勻,，并輕微離心后使用,，避免起泡。沒有混勻試劑,、使用振蕩器混勻,、未在冰上配置試劑等會導(dǎo)致反應(yīng)性能下降。
將細胞轉(zhuǎn)移至離心管中*,，5000 rpm離心2 min收集細胞**,，充分吸除培養(yǎng)基。若貼壁細胞在96孔板中培養(yǎng),，可直接吸除培養(yǎng)基,。
各個孔內(nèi)加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗細胞,，5000 rpm離心2 min,，吸盡FCD Washing Buffer,。
各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase I溶液,，室溫吸打混勻后靜置5 min,，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混勻5次左右，即可得到裂解產(chǎn)物****,，細胞數(shù)量超過1× 105 cells時可能會有裂解殘留物屬正?，F(xiàn)象。
*50 μL裂解體系適配細胞數(shù)的基本要求是每孔1× 102 - 1× 105 cells,，若細胞數(shù)量較多,，可適當(dāng)?shù)缺壤黾覨CD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。
**不同細胞的離心條件不同,，請使用適合于所用細胞的離心速度進行離心,。
***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依實驗需要,，加入裂解液量增大時需相應(yīng)增大FCD Stop Solution的量,。
****細胞裂解產(chǎn)物溶液長期保存時，請置于-25~-15℃,。
二,、反轉(zhuǎn)錄
室溫融化4× Hifair® FCD RT Mix后輕微顛倒混勻，置于冰上并按下表配置反應(yīng)體系：
組分 | 體積 （μL） | 終濃度 |
4× Hifair® FCD RT Mix | 5 | 1× |
裂解產(chǎn)物* | x | - |
RNase-free H2O | Up to 20 | - |
表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
*避免吸入細胞碎片,，推薦使用量為2 μl,，最大不超過反應(yīng)體系的55%。
移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液,，按下表程序進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)**：
反應(yīng)溫度 | 反應(yīng)時間 |
37℃ | 5 min |
85℃ | 5 sec |
表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序
**反轉(zhuǎn)錄溫度推薦使用37℃,，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接進行下游qRT-PCR檢測。為避免反轉(zhuǎn)錄體系對qPCR反應(yīng)的抑制,，得到合適的Ct值（10-35）,，可將產(chǎn)物稀釋10-1000倍后使用。若短時間內(nèi)不進行下游實驗,，可放置于-25~-15℃保存,。
三、熒光定量PCR
體系配置
使用下列組份比例配制反應(yīng)液（配制過程請于冰上進行）：
組分 | 體積（μL） | 終濃度 |
2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix | 12.5 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 200 nM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 200 nM |
Probe (10 μM) | 0.25-1 | 100-400 nM |
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物* | x | - |
RNase-free H2O | Up to 25 | - |
表3 qPCR反應(yīng)體系
*高濃度模板易導(dǎo)致非特異擴增,，可適當(dāng)將模板稀釋5-50倍,。模板推薦用量4 μL。反應(yīng)性能較差時,，可以在0.2-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物探針濃度,。
熒光定量PCR快速擴增程序（推薦）
本產(chǎn)品推薦使用快速程序擴增，可大大減少反應(yīng)時間。使用Tm值較低的引物難以擴增時,，可額外調(diào)整退火溫度,。
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 95℃ | 10 sec | 1 |
變性 | 95℃ |
| 45 |
退火/延伸** | 60℃ | 10 sec |
表4 qPCR反應(yīng)程序（快速）
**退火/延伸溫度,、終延伸時間可根據(jù)實驗要求適當(dāng)調(diào)整,。 快速程序適用于絕大多數(shù)基因，個別復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)基因可嘗試常規(guī)程序,。
熒光定量PCR常規(guī)擴增程序
實驗儀器不滿足快速反應(yīng)時間時,，也可使用常規(guī)程序進行擴增。
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 95℃ | 10 sec | 1 |
變性 | 95℃ |
| 40-45 |
退火/延伸** | 60℃ | 30 sec |
表5 qPCR反應(yīng)程序（常規(guī)）
注意事項
使用前,，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。
實驗時,，請盡量使用無污染的耗材，避免污染,。
本產(chǎn)品避免反復(fù)凍融,，配制時應(yīng)避免強光照射,。
為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
本產(chǎn)品僅作科研用途,！
