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13311ES16Hieff NGS® Ultima Pro DNA Library Prep Kit fo
| 參考價(jià): | 面議 |
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)- 13311ES16 產(chǎn)品型號(hào)
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問次數(shù)：441更新時(shí)間：2023-03-15 08:57:54
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產(chǎn)品簡介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 16T |
|---|---|---|---|
| 貨號(hào) | 13311ES16 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè) |
產(chǎn)品介紹
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱
產(chǎn)品編號(hào)
規(guī)格
價(jià)格（元）
Hieff NGS® Ultima Pro DNA Library Prep Kit for MGI®
13311ES16
16 T
4965.00
13311ES96
96 T
29565.00
產(chǎn)品描述
Hieff NGS® Ultima Pro DNA Library Prep Kit for MGI®是針對(duì)MGI®高通量測(cè)序平臺(tái)專業(yè)開發(fā)設(shè)計(jì)的新一代建庫試劑盒,。本產(chǎn)品采用高質(zhì)量的酶學(xué)組成,，在前一代建庫試劑盒的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了DNA片段末端修復(fù)和加A效率,，同時(shí)改善接頭連接效率,。本試劑盒采用了新型的高保真酶，顯著提高擴(kuò)增均一性和保真性,，可應(yīng)用于常規(guī)動(dòng)植物基因組,、微生物基因組、FFPE,、cfDNA,、ChIP DNA等樣本，助力獲得優(yōu)異的測(cè)序數(shù)據(jù),。
適用500 pg-500 ng所有DNA樣本,，包含cfDNA,、FFPE等
業(yè)界的文庫轉(zhuǎn)化率，最高可達(dá)70%以上
多樣本驗(yàn)證可獲得優(yōu)異的文庫與測(cè)序數(shù)據(jù)
嚴(yán)格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控
產(chǎn)品組分
組分編號(hào)
組分名稱
產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
13311ES16
13311ES96
13311-A
Endprep Buffer 2.0
96 μL
576 μL
13311-B
Endprep Enzyme
64 μL
384 μL
13311-C
Ligation Enhancer
480 μL
3×960 μL
13311-D
Novel T4 DNA Ligase
80 μL
480 μL
13311-E
Canace® Pro Amplification Mix
400 μL
3×800 μL
13311-F
Primer Mix for MGI®
80 μL
480 μL
運(yùn)輸與保存方法
冰袋運(yùn)輸,。所有組分-20°C保存,，有效期1年。
注意事項(xiàng)
一,、關(guān)于操作
1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。
2. 請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍,。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用,。
3. 配制各步驟反應(yīng)液時(shí)推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩,，劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫產(chǎn)出下降。
4. 為避免樣品交叉污染,，推薦使用帶濾芯的槍頭,，吸取不同樣品時(shí)請(qǐng)更換槍頭。
5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng),，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近,。
6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性,。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離,；使用專用的移液器等設(shè)備；并定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理）,，以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度,。
二、關(guān)于DNA片段化
1. 本試劑盒中兼容機(jī)械法及酶切法片段化的DNA,。
2. 本試劑盒兼容范圍為500 pg - 500 ng Input DNA,。應(yīng)盡可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。表1中列舉了將本試劑盒應(yīng)用于常見應(yīng)用中推薦的Input DNA量,。
表1 常見應(yīng)用中推薦Input DNA量
應(yīng)用
樣本類型
推薦Input DNA量
全基因組測(cè)序
復(fù)雜基因組
50 ng-500 ng
靶向捕獲測(cè)序
復(fù)雜基因組
10 ng-500 ng
全基因組測(cè)序,，靶向捕獲測(cè)序
FFPE DNA
50 ng-500 ng
全基因組測(cè)序，靶向捕獲測(cè)序
cfDNA/ctDNA
≥500 pg
全基因組測(cè)序
微生物基因組
≥1 ng
全基因組測(cè)序PCR-free測(cè)序
高質(zhì)量DNA
≥50 ng
【注】：上表為使用高質(zhì)量DNA時(shí)推薦的Input DNA量,，當(dāng)Input DNA質(zhì)量較差或需要進(jìn)行片段分選時(shí),，應(yīng)適當(dāng)上調(diào)使用量。
3. Input DNA特指投入末端修復(fù)/dA尾添加步驟中的DNA,。
4. Input DNA制備過程中帶入的高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽,，可能會(huì)影響末端修復(fù)/dA尾添加步驟反應(yīng)效率，建議DNA片段化后進(jìn)行磁珠純化或分選,。當(dāng)使用機(jī)械法進(jìn)行DNA片段化且產(chǎn)物不進(jìn)行純化或長度分選而直接建庫時(shí),，請(qǐng)將DNA稀釋在TE Buffer中進(jìn)行片段化,，請(qǐng)勿在滅菌超純水中進(jìn)行。當(dāng)使用酶切法進(jìn)行片段化且產(chǎn)物不進(jìn)行純化或長度分選而直接建庫時(shí),，請(qǐng)確認(rèn)Stop Buffer中不包含過量的金屬離子螯合劑,。如條件不滿足，可先將片段化產(chǎn)物純化或長度分選后溶于TE buffer或滅菌超純水中（≤50 μL）,，再進(jìn)行文庫構(gòu)建,。
三、關(guān)于接頭連接（Adapter Ligation）
1.目前華大智造有2種序號(hào)的接頭：1-128和501-596,。關(guān)于其使用要求,，請(qǐng)?jiān)斠娙A大智造“關(guān)于Adapter使用"有關(guān)說明或咨詢本公司。此外,，華大智造申明：2種接頭由于設(shè)計(jì)工藝不同,，禁止混用,，否則測(cè)序數(shù)據(jù)無法拆分,！
2. Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產(chǎn)量,。請(qǐng)按照表2和實(shí)際DNA投入量確實(shí)確定接頭用量,，需要稀釋接頭時(shí),，請(qǐng)用TE buffer對(duì)接頭進(jìn)行稀釋,。
表2 500pg-1 μg Input DNA推薦的Adapter使用量
Input DNA
10μM Adapter稀釋倍數(shù)
稀釋后投入量（μL）
31ng-1 μg
不稀釋
5
11-30 ng
5
5
3-10 ng
10
5
0.5-2 ng
20
5
四,、關(guān)于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）
1. DNA片段長度分選步驟可選擇在末端修復(fù)/dA尾添加之前,，或接頭連接后,，或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行,。
2. 當(dāng)Input DNA質(zhì)量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選,；如Input DNA質(zhì)量<50 ng,，建議您在文庫擴(kuò)增后進(jìn)行分選。
3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG,，會(huì)對(duì)雙輪磁珠分選產(chǎn)生顯著影響,。因此，如在接頭連接后進(jìn)行長度分選,，必須先進(jìn)行純化步驟,，再進(jìn)行雙輪分選步驟；如在末端修復(fù)/dA尾添加之前或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行長度分選,，可直接進(jìn)行雙輪磁珠分選步驟,。
4. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降,、分選效果不佳,。
5. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。
6. 轉(zhuǎn)移上清時(shí),，請(qǐng)勿吸取磁珠,，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量,。
7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率,。
8. 進(jìn)行長度分選時(shí),，初始樣品體積應(yīng)盡量≥100 μL，不足時(shí)請(qǐng)用超純水補(bǔ)齊,。以防因樣品體積太小導(dǎo)致移液誤差增大,。
9. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng),；過分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率,。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥,。
10. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫,，產(chǎn)物可于4°C可保存1-2周,，-20°C可保存1個(gè)月。
五,、關(guān)于文庫擴(kuò)增（Library Amplification）
1. 是否需要進(jìn)行文庫擴(kuò)增取決于Input DNA量,、Adapter是否為完整長度、應(yīng)用需要等因素,。如使用非完整長度Adapter,，必須進(jìn)行這一步驟。如使用完整長度Adapter,，當(dāng)Input DNA<200 ng時(shí),，推薦進(jìn)行文庫擴(kuò)增；當(dāng)Input DNA≥200 ng或者不需要進(jìn)行文庫擴(kuò)增時(shí),，可不進(jìn)行文庫擴(kuò)增,。
2. 文庫擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足,，將導(dǎo)致文庫產(chǎn)量低,；循環(huán)數(shù)過多，又將導(dǎo)致文庫偏好性增加,、重復(fù)度增加,、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果,。表3列舉了使用本試劑盒,，獲得100 ng或1000 ng文庫的推薦循環(huán)數(shù)。
表3 500 pg-1 μg Input DNA獲得100 ng或1000 ng產(chǎn)物擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表
Input DNA ( Into End Preparation )
Number of cycles required to generate
100 ng
1000 ng
1 μg
0
3 - 4
500 ng
0
4 - 5
250 ng
1 - 4
5 - 7
100 ng
2 - 5
6 - 8
50 ng
4 - 7
7- 10
10 ng
6 - 8
10- 12
5 ng
7 - 10
11 - 14
1 ng
9 - 11
13 - 15
500 pg
11 - 13
14 - 16
【注】：建庫過程中進(jìn)行過長度分選時(shí)參照較高循環(huán)數(shù)擴(kuò)增,。
六,、關(guān)于文庫質(zhì)檢（Library Quality Analysis）
1. 通常情況下,，構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。
2. 文庫濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法,，如Qubit®,、PicoGreen®等；基于qPCR絕對(duì)定量的方法,。
3. 文庫濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法,，如NanoDrop®等。
4. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫濃度檢測(cè)：Qubit®,、PicoGreen®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí),，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物,；qPCR絕對(duì)定量基于PCR擴(kuò)增原理,，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測(cè)序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫干擾,。
5. 文庫長度分布檢測(cè),，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。
使用方法
一,、自備材料
1. 純化磁珠：Cat#12601,，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品,。
2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品,。
3. DNA Adapter：咨詢華大智造或本公司。
4. 其他材料：無水乙醇,、滅菌超純水,、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）,、低吸附EP管,、PCR管、磁力架,、PCR儀等,。
二、操作流程
圖1 Ultima Pro DNA建庫試劑盒操作流程
三,、操作步驟
3.1 末端修復(fù)/dA尾添加（End Preparation/dA-Taling）
該步驟將Input DNA末端補(bǔ)平,，并進(jìn)行5’端磷酸化和3’端加dA尾。
1. 將表4中各試劑解凍后,，顛倒混勻,，置于冰上備用。
2. 于無菌PCR管中配制表4所示反應(yīng)體系。
表4 末端修復(fù)/dA尾添加PCR反應(yīng)體系
名稱
體積（μL）
Fragmented DNA
x
Endprep Buffer 2.0
6
Endprep Enzyme
4
ddH2O
Up to 60 μL
3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻,，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底,。
4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表5所示反應(yīng)程序,，進(jìn)行末端修復(fù)/dA尾添加反應(yīng),。
表5 末端修復(fù)/dA尾添加PCR反應(yīng)程序
溫度
時(shí)間
熱蓋105°C
On
30°C
20 min
72°C
20 min
4°C
Hold
3.2 接頭連接（Adapter Ligation）
該步驟將3.1步驟的產(chǎn)物末端，連接特定的MGI®接頭,。
1. 根據(jù)Input DNA量按表2稀釋Adapter至合適濃度,。
2. 將表6中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用,。
3. 于3.1步驟PCR管中配制表6所示反應(yīng)體系,。
表6 Adapter Ligation PCR體系
名稱
體積（μL）
dA-tailed DNA（3.1步驟產(chǎn)物）
60
Ligation Enhancer
30*
DNA Adapter
5**
Novel T4 DNA Ligase
5
【注】：*Ligation Enhancer比較粘稠,，請(qǐng)上下顛倒,、振蕩，充分混勻并瞬時(shí)后離心使用,。
4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻,，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
5. 將PCR管置于PCR儀中,，設(shè)置表7所示反應(yīng)程序,，進(jìn)行接頭連接反應(yīng)：
表7 Adapter Ligation PCR反應(yīng)程序
溫度
時(shí)間
熱蓋105°C
Off
20°C
15 min
4°C
Hold
【注】：當(dāng)Input DNA量較低,，實(shí)驗(yàn)效果不理想時(shí),，可嘗試將連接時(shí)間延長一倍。
3.3 連接產(chǎn)物磁珠純化（Post Ligation Clean Up）
該步驟使用磁珠對(duì)3.2步驟的產(chǎn)物進(jìn)行純化或分選,。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無效產(chǎn)物,。
3.3.1 純化操作步驟：
1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min,。配制80%乙醇,。
2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.6×,，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中,，室溫孵育5 min。
4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移除上清。
5. 保持PCR管始終置于磁力架中,，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重復(fù)步驟5,，總計(jì)漂洗兩次,。
7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）,。
8. 將PCR管從磁力架中取出,，進(jìn)行洗脫：
1）如產(chǎn)物無需進(jìn)行片段分選，直接加入21 μL ddH2O,，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,，室溫靜置5 min?！咀ⅰ浚喝缂兓a(chǎn)物如需保存,，可使用TE Buffer洗脫。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠,。
2）如產(chǎn)物需進(jìn)行雙輪分選,，加入102 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,，室溫靜置5 min,。【注】：如純化產(chǎn)物如需保存,，可使用TE Buffer洗脫,。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移取100 μL上清至新PCR管中,，切勿觸碰磁珠。
3.3.2 雙輪分選操作步驟：
1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,，室溫平衡約30 min,。配制80%乙醇。
2. 請(qǐng)渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻,。
3. 根據(jù)DNA片段長度要求,，參考表8向上述100 μL DNA上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻,。
表8 磁珠文庫分選推薦比例
DNA文庫插入片段大小
150-250 bp
250-350 bp
350-450 bp
450-550 bp
550-650 bp
DNA文庫大小
250-350 bp
350-450 bp
450-550 bp
550-650 bp
650-750 bp
第一輪體積比（Beads:DNA）
0.80×
0.70×
0.60×
0.55×
0.50×
第二輪體積比（Beads:DNA）
0.20×
0.20×
0.20×
0.15×
0.15×
【注】：表中“×"表示樣品DNA體積,。如文庫插入片段長度為200 bp，樣品DNA體積為100 μL,，則第一輪分選磁珠使用體積為0.8×100 μL=80 μL,；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL,；表中所推薦比例是針對(duì)于Adapter Ligated Insert DNA（Post Ligation），如果用戶在接頭連接前進(jìn)行分選,，請(qǐng)采用Hieff NGS® DNA Selection Beads（Cat#12601）說明書中推薦的比例,。
4. 室溫孵育5 min。
5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中,，待溶液澄清后（約5 min）,，小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中。
6. 參考表8向上清中加入第二輪分選磁珠,。
7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻,，室溫靜置5 min。
8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中,，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移除上清。
9. 保持PCR管始終處于磁力架中,，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,，室溫孵育30 sec，小心移除上清,。
10. 重復(fù)步驟9,。
11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）,。
12. 將PCR管從磁力架中取出,，加入適量21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻,，室溫靜置5 min,。
13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min）,，小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中,。
3.4 文庫擴(kuò)增（Library Amplification）
該步驟將對(duì)純化或長度分選后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集,。
1. 將表9中試劑解凍后顛倒混勻,，置于冰上備用。
2. 于無菌PCR管中配制表9所示反應(yīng)體系,。
表9 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
名稱
體積（μL）
Adapter Ligated DNA（3.3步驟產(chǎn)物）
20
Canace® Pro Amplification Mix
25
Primer Mix for MGI®
5
3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻,，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
4. 將PCR管置于PCR儀中,，設(shè)置表10所示反應(yīng)程序,，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
表10 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序
溫度
時(shí)間
循環(huán)數(shù)
98°C
1 min
1
98°C
10 sec
參照注意事項(xiàng)中表3
60°C
30 sec
72°C
30 sec
72°C
5 min
1
4°C
Hold
-
3.5 擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠純化或分選（Post Amplification Clean Up/Size Selection）
同3.3.1步驟中純化操作步驟,。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×,，Beads:DNA=0.9:1）純化文庫擴(kuò)增產(chǎn)物。
如需分選，操作方法同3.3.2雙輪分選步驟（純化步驟可省略）,。
3.6 文庫質(zhì)量控制
通常情況下,，構(gòu)建好的文庫可通過濃度檢測(cè)和長度分布檢測(cè)來進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體請(qǐng)參見注意事項(xiàng)六,。
3.7 參考實(shí)例
1．使用Hieff NGS® Ultima Pro DNA Library Prep Kit for MGI®對(duì)100 ng FFPE樣本建庫（未分選）,，結(jié)果使用Agilent 2100 DNA 1000 Chip進(jìn)行檢測(cè)。
圖2 Ultima Pro DNA建庫試劑盒用于FFPE樣本建庫（未分選）2．使用Hieff NGS® Ultima Pro DNA Library Prep Kit for MGI®對(duì)10 ng cfDNA樣本建庫,，結(jié)果使用Agilent 2100 DNA高靈敏芯片檢測(cè),。
圖3 Ultima Pro DNA建庫試劑盒用于cfDNA樣本建庫HB220316
