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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

B-27是一種最常被引用的神經(jīng)細胞培養(yǎng)添加劑，是一種優(yōu)化的無血清添加劑,，用于支持胚胎,、出生后和成年海馬神經(jīng)元和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）神經(jīng)元的生長和活性維持。B-27無血清添加劑以50倍工作液提供,，旨在與神經(jīng)基底培養(yǎng)基一起使用,，神經(jīng)基底培養(yǎng)基用于神經(jīng)細胞培養(yǎng)，無需星形膠質(zhì)細胞飼養(yǎng)層,。

在神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基中使用B-27添加劑,，用于培養(yǎng)產(chǎn)前和胚胎神經(jīng)元，以獲得優(yōu)化的活性和長期的存活率,。

在神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基中使用B-27添加劑,，用于培養(yǎng)神經(jīng)來源的腫瘤細胞系，可有效地保證其活性,。

在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加B-27添加劑,，已被證明可支持擴增來自小鼠胚胎紋狀體和中腦的EGF響應(yīng)性的前體細胞,。

本產(chǎn)品從標準配方中去除了全部5種抗氧化劑，以利于在氧化應(yīng)激及損傷,、氧自由基對神經(jīng)損傷和凋亡的研究中排除抗氧化劑的干擾,。

本產(chǎn)品供科學(xué)研究和生產(chǎn)使用，用于組織和細胞的體外培養(yǎng),。

產(chǎn)品性質(zhì)

運輸和保存方法

干冰運輸,。-30 ~ -5℃保存,，24個月有效。

使用方法

1.*培養(yǎng)基制備

置于4°C解凍本產(chǎn)品,。

在使用前無菌添加2%本產(chǎn)品和0.5 mM L-谷酰胺至神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基,，配制成神經(jīng)元*培養(yǎng)基（注：下文中出現(xiàn)的“神經(jīng)元*培養(yǎng)基"即指此種添加了B-27添加劑和L-谷酰胺的神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基）注意：剩余的本產(chǎn)品可以等分成工作體積，并儲存在-30 ~ -5℃,。在以后的試驗中根據(jù)需要解凍相應(yīng)體積的本產(chǎn)品,。避免反復(fù)凍融。

對于原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng),，神經(jīng)元*培養(yǎng)基（由前述步驟制備）需要額外補充25 μM的L-谷酸,，在培養(yǎng)的第4天以后的換液中應(yīng)不再添加谷酸。配置好的*培養(yǎng)基,，可于2-8℃的避光保存一周。

2.細胞培養(yǎng)步驟

下列步驟已在大鼠胎兒原代海馬和皮層神經(jīng)元,，以及神經(jīng)母細胞瘤細胞系中測試,。

用無菌的冷的0.05 mg/mL多聚賴氨酸水溶液包被培養(yǎng)表面(玻璃或細胞培養(yǎng)級塑料)，每平方厘米表面使用0.15 mL,，在室溫下保溫1 h,。

去除多聚賴氨酸溶液，并用無菌蒸餾水沖洗兩次(須*清洗,，因為多聚賴氨酸對細胞有毒性),。在超凈工作臺中打開培養(yǎng)板的蓋子通風(fēng)，直到每個孔都*干燥,。培養(yǎng)板干燥后可以立即使用或在4°C最多保存2周,。

根據(jù)標準實驗室程序或隨細胞提供的說明書分離原代的大鼠神經(jīng)元或解凍凍存的原代大鼠神經(jīng)元。

在預(yù)熱的(37°C)神經(jīng)元*培養(yǎng)基中（如前所述的方法制備)接種細胞,，建議的細胞密度為160個細胞/mm2,，或必要時使用自行優(yōu)化的細胞密度。注意：對于海馬神經(jīng)元,，培養(yǎng)基中須添加25μM L-谷酸,，參見“*培養(yǎng)基的制備",。

在36°C至38°C，含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)（使用自然空氣也是可接受的,，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環(huán)境）,。

培養(yǎng)4-24小時后，更換一半體積的新鮮培養(yǎng)基,，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

對海馬神經(jīng)元以外的細胞：在接種4天后，更換一半體積的新鮮的*培養(yǎng)基,，之后每三天重復(fù)一次,。對海馬神經(jīng)元：接種三天后，用不含L-谷酸的新鮮培養(yǎng)基更換一半體積的培養(yǎng)基,。之后每三天重復(fù)一次,。注意：在*培養(yǎng)基中添加25 µM 2-，可改善海馬神經(jīng)元的長期存活率,。

3.分離原代大鼠胚胎神經(jīng)元

下列程序推薦用于培養(yǎng)受精18天的大鼠胚胎海馬神經(jīng)元和大腦皮層神經(jīng)元,。

從受精18天的大鼠胚胎中分離大腦皮層和雙側(cè)海馬

在預(yù)置了Hibernate-E*培養(yǎng)基的錐形管中收集所有的組織。放置,，直到所有的組織都已解體,。

使組織沉積在管的底部，然后小心地去除上清液,，只留下剛好可覆蓋組織的最少量的培養(yǎng)基,。

在不含鈣離子的Hibernate-E培養(yǎng)基中，使用2 mg/mL過濾滅菌的木瓜蛋白酶溶液,，在30°C酶解組織大約30 min,，其間每5 min輕搖錐形管以幫助降解。每對海馬組織使用2 mL酶溶液,。

加入兩倍體積的Hibernate-E*培養(yǎng)基以恢復(fù)二價陽離子的濃度,，停止酶解。

使未解離的組織沉降至管底（約2 min）,，然后把上清液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中,，以150×g離心5 min。

在1 mL神經(jīng)元*培養(yǎng)基中重懸沉淀物,，取一小份(例如10 μL)進行細胞計數(shù),。后續(xù)的操作按照“復(fù)蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元"的第8-10步驟進行。

4.復(fù)蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元

重要提示：原代神經(jīng)元細胞將會貼附在裸露的塑料或玻璃表面,，建議事先用神經(jīng)元*培養(yǎng)基沖洗所有的塑料和玻璃器皿的內(nèi)表面,，以獲得最高的回收率和產(chǎn)量。由于細胞從凍存狀態(tài)復(fù)蘇時極其脆弱，請在整個操作過程中不要震蕩或離心細胞,。我們建議每次只解凍一管細胞,。務(wù)必減少從液氮中轉(zhuǎn)移凍存管到37°C水浴中的操作時間。細胞從液氮罐到水浴的運輸過程中,，可在冰桶中放少量液氮,，將細胞置于這個冰桶中來進行。

在解凍細胞之前,，用神經(jīng)元*培養(yǎng)基沖洗無菌的15 mL錐形管,，然后在超凈工作臺中通風(fēng)晾干。

從液氮中取出凍存管時可稍微擰松管帽以釋放壓力,，然后再擰緊,。

在37°C水浴中輕柔攪拌凍存管以快速解凍細胞（小于2 min）。當(dāng)觀察到凍存管中只有很少量的冰晶存在時（觸摸凍存管仍然感覺是冷的）從水浴中取出,。

在超凈工作臺中用70%的異丙醇消毒凍存管,。在工作臺臺面上輕敲凍存管以使管內(nèi)液體沉降到管底。

使用事先用神經(jīng)元*培養(yǎng)基沖洗并干燥過的1 mL吸頭極其輕柔地將細胞轉(zhuǎn)移到事先沖洗并干燥的15 mL錐形管中,。

用1 mL預(yù)熱的神經(jīng)元*培養(yǎng)基沖洗沖洗凍存管,，以每秒一滴的速度極其緩慢地加入到15 mL錐形管中的細胞里。每加一滴都輕柔地轉(zhuǎn)動錐形管一次,。不要一次即把全部培養(yǎng)基加到錐形管中,。

慢慢地逐滴加入另外2 mL預(yù)熱的*培養(yǎng)基，使管內(nèi)的液體體積為4 mL,。用1 mL吸頭輕柔地混合液體,，注意不要造成任何氣泡。

用一個事先沖洗干燥過的吸頭吸取10 μL細胞懸液加入到含有10 μL 0.4%臺盼藍的微量離心管中,，輕敲管壁以混勻溶液,。使用手動的細胞計數(shù)方法測定活細胞密度。解凍的細胞的活率應(yīng)超過50%,。

在已經(jīng)事先用多聚賴氨酸包被（參見“細胞培養(yǎng)步驟"）的48孔板中每孔中接種大約1×10 5個細胞或按所需的細胞密度接種。加入預(yù)熱的神經(jīng)元*培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋到每孔500 μL,。

按照“細胞培養(yǎng)步驟"中的5-6步驟進行神經(jīng)元的培養(yǎng),。在36°C至38°C，含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)（使用自然空氣也是可接受的,，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環(huán)境）,。

HB211229