Hieff NGS® eTAPS酶法DNA甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff NGS^® eTAPS Enzymatics Methyl-seq Conversion Module是翌圣生物科技（上海）股份有限公司開發(fā)的一款高效DNA甲基化位點轉(zhuǎn)化試劑盒（eTAPS技術(shù)）,，可以將甲基化的胞嘧啶（5mC）特異性地轉(zhuǎn)化成尿|嘧|啶（U）。最終，eTAPS技術(shù)可以高效特異性地將甲基化的胞嘧啶（5mC）轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶（T）,，通過C>T突變來實現(xiàn)單堿基分辨率和高準(zhǔn)確性的DNA甲基化正向篩選和鑒定,，適用于1-200 ng起始量的DNA樣本。本試劑盒流程包括eTET酶氧化,、轉(zhuǎn)化劑轉(zhuǎn)化和磁珠回收三個步驟,，具有轉(zhuǎn)化效率高、操作簡便,、特異性好、回收率高等優(yōu)點,。

產(chǎn)品組分

運輸與保存方法

干冰運輸,。效期一年。-20℃保存,，切不可搞錯,！

注意事項

一、 關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻,，短暫離心后置于冰上待用,。

3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近,。

4. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染,，進而影響實驗結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離,；配備文庫構(gòu)建專用移液器等設(shè)備,；定時對各實驗區(qū)域進行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除噴霧），以保證實驗環(huán)境的潔凈度,。

5. 本產(chǎn)品僅用作科研用途,！

二、應(yīng)用范圍

本試劑盒適用于DNA甲基化（DNA 5mC）研究,，針對的DNA投入量為1-200 ng,，也提供了應(yīng)用于RNA 甲基化（RNA 5mC）的可能性。

三,、關(guān)于DNA材料

1. 請不要用包含EDTA的緩沖液溶解DNA材料,。若溶解DNA的緩沖液中包含EDTA，我們推薦先進行NGS建庫,，在PCR擴增前再使用本試劑盒進行DNA甲基化轉(zhuǎn)化,。

四、關(guān)于試劑和操作注意事項

1. eTET1為二價金屬依賴性DNA雙加氧酶，因此對氧化體系中EDTA較為敏感,。請不要用包含EDTA的緩沖液溶解DNA材料,。若使用EDTA的緩沖液溶解DNA材料，我們建議進行一輪DNA回收進行純化,，或者對eTET1 Enhancer的投入量進行重新滴定,，以達到eTET1最佳的氧化效果。對于DNA NGS建庫,，若起始DNA溶解液較為復(fù)雜,，建議先進行DNA建庫步驟（如DNA|片段化、末端修復(fù),、接頭連接和磁珠回收）,，使用ddH2O溶解回收的DNA，再使用本試劑盒對DNA進行eTAPS轉(zhuǎn)化,，最后進行文庫擴增,。

2. eTET1 Enhancer容易被氧化，收到后建議分裝保存于-20℃,。短時間內(nèi)不用,，建議-80℃保存。

3. Conversion Enhancer有輕微揮發(fā)性和刺激性,，使用時請保證操作環(huán)境通風(fēng),，并戴好口罩和防護眼鏡。

4. Neutralizer具有強堿性,，在使用過程中請做好防護,。滴到皮膚上，應(yīng)先用干凈布拭去,，然后用大量水清洗,，最后涂抹稀硼酸稀溶液。滴到實驗臺上,，用濕抹布擦去即可,。

5. 2 × HiFi Uracil Plus PCR Mix是耐尿|嘧|啶的超高保真DNA聚合酶反應(yīng)液，主要用于eTAPS轉(zhuǎn)化后DNA的擴增,。在NGS建庫過程中,，請用此酶代替建庫試劑盒中的擴增mix，以保證更高效的文庫擴增和保真性,。若使用轉(zhuǎn)座酶法建庫,，則無須進行擴增mix的替換。

五,、關(guān)于DNA甲基化標(biāo)準(zhǔn)品

Specific Methylated Site DNA使用的是一段人工合成的DNA|片段,，片段上包含三個DNA甲基化位點,，兩個甲基化位點主要用于評判eTAPS的轉(zhuǎn)化效率。序列如下(下劃線堿基C即為甲基化的C)：

AGTGACGCATGATCTGTACGATCGACCGTGCAACCCGACGCATGATCTGTACTGATCGACCGTGCAACAGCAGTCTCGATCAGCTGCTCCGCATGCAAGTAGCGGTACTAACGTACAGTACGATGCTAGCTAGTGCTTAGGATCGAGATCGCAGAAGGGCAAGCATTAGCTATCGATCGAGCACTACTAGCTAGCATCCGATCGATCATCGTCACGGTACGTCCAGC,。

Specific Methylated Site DNA的濃度為100 pg/μL,，在使用過程中請根據(jù)自身DNA投入量進行添加。我們推薦的投入DNA和Specific Methylated Site DNA比例為100-1000:1,。

六,、自備材料

1. DNA回收：我們推薦使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)進行DNA回收，也可以使用柱回收和

AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進行代替,。

2. DNA建庫試劑盒：我們推薦使用以下DNA建庫試劑盒進行illumina或者MGI文庫的構(gòu)建：

全能型DNA建庫試劑盒(Yeasen Cat#12199,、12200、12201,、13310)

一步法DNA建庫試劑盒(Yeasen Cat#12203,、12204、12205,、13321,、13322)

單鏈DNA建庫試劑盒(Yeasen Cat#12211)

3. 其他材料：無水乙醇,、無菌超純水,、低吸附槍頭、PCR管,、磁力架,、PCR儀、恒溫震蕩儀等,。

使用方法

一,、操作流程

圖1.eTAPS酶法DNA甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒原理示意圖和建庫操作流程

二、操作步驟（操作前請仔細閱讀操作注意事項）

2.1 eTET1酶處理

1. 將表1中試劑解凍后顛倒混勻,，置于冰上備用（eTET1 Enhancer解凍混勻后放置在冰上）,。

2. 于無菌PCR管中配制表1所示反應(yīng)體系。

表1 eTET1氧化反應(yīng)體系

3. 37℃反應(yīng)1.5 h,。加入1 μL Termination Buffer和1 μL Termination Enzyme,。（若為了更好的轉(zhuǎn)化效果，此處可以將PCR管放在PCR儀中50 ℃處理 10 min）,。

2.2 轉(zhuǎn)化劑處理

1. 將表2中試劑解凍后顛倒混勻,，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表2所示反應(yīng)體系,。

表2 轉(zhuǎn)化劑處理反應(yīng)體系

【注】：Conversion Enhancer和Reagent需要單獨添加,，請不要提前混成mix,。

3. 37℃反應(yīng)14-18 h（混勻后可以在PCR儀中反應(yīng)，熱蓋50℃）,。

4. 反應(yīng)結(jié)束后,，加入22 μl Neutralizer，混勻,。

2.3 磁珠回收

1. 加入120 μL室溫下平衡的DNA Selection Beads,，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置孵育10-15 min,。

2. 短暫離心（<100×g）,，將離心管置于磁力架上靜置3 min，待磁珠*貼壁后吸除PCR管中溶液,。保持PCR管始終處于磁力架中,，從另一側(cè)加入200 μL 80％乙醇，避免直接沖刷磁珠,，靜置60 s,。吸除液體，保持PCR管始終處于磁力架中,，再次加入200 μL 80％乙醇,，靜置60 s。吸除干凈液體,，保持PCR管始終處于磁力架中,，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過3 min）。從磁力架上取下PCR管,，加入21 μL ddH2O,，并充分渦旋。室溫靜置5 min,。

3. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中,，于-20℃保存,。

2.4 DNA建庫

按照推薦的試劑盒說明書進行文庫構(gòu)建。我們推薦使用以下DNA建庫試劑盒進行illumina或者MGI文庫的構(gòu)建：

全能型DNA建庫試劑盒(Yeasen Cat#12199,、12200,、12201、13310)

一步法DNA建庫試劑盒(Yeasen Cat#12203,、12204,、12205、13321,、13322)

轉(zhuǎn)座酶DNA建庫試劑盒（Yeasen Cat#12206,、12207）

單鏈DNA建庫試劑盒(Yeasen Cat#12211)

【注】2 × HiFi Uracil Plus PCR Mix是耐尿|嘧|啶的超高保真DNA聚合酶反應(yīng)液,，主要用于eTAPS轉(zhuǎn)化后DNA的擴增。在NGS建庫過程中,，請用此酶代替建庫試劑盒中的擴增mix,，以保證更高效的文庫擴增和保真性。

HB211029