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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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Library Convert Kit/NGS文庫轉換試劑盒
| 參考價: | 面議 |
具體成交價以合同協(xié)議為準- 產(chǎn)品型號
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問次數(shù)：507更新時間：2025-02-07 13:45:01
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產(chǎn)品簡介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 16 T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 13342ES16 | 應用領域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè) |
產(chǎn)品介紹
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 價格（元） |
Hieff NGS® Universal Library Convert Kit/NGS文庫轉換試劑盒 | 13342ES16 | 16 T | 1165 |
13342ES96 | 96 T | 5835 |
產(chǎn)品描述
該試劑盒可以將Illumina試劑盒構建的雙鏈線性文庫轉化為兼容華大智造測序平臺的環(huán)狀ssDNA文庫,。構建的文庫可使用BGISEQ-500RS,、 MGISEQ-200RS 和 MGISEQ-2000RS 進行測序,。
產(chǎn)品組分
組分編號與名稱 | 13342ES16 | 13342ES96 | ||
13342-A |
| AC-PCR Amplification mix | 400 μL | 2×1200 μL |
13342-B |
| AC-PCR Primer mix | 16 μL | 96 μL |
13342-C |
| App-A Splint Buffer | 240 μL | 2×720 μL |
13342-D |
| Ligase | 80 μL | 480 μL |
13342-E |
| Digestion Buffer | 130 μL | 780 μL |
13342-F |
| Digestion Enzyme | 32 μL | 192 μL |
運輸與保存方法
干冰運輸,。
所有組分-20°C保存，有效期1年,。
*當運輸條件,、儲存條件及使用方式都正確時，所有組分在有效期內(nèi)均能保持完整活性,。
注意事項
一,、關于操作
1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。
2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍,。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用,。
3. 配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩,，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。
4. 為避免樣品交叉污染,，推薦使用帶濾芯的槍頭,，吸取不同樣品時請更換槍頭。
5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應,，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近,。
6. 定時對各實驗區(qū)域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。
7. 本產(chǎn)品僅作科研用途,！
二,、樣本要求及處理
2.1樣本要求
樣本為線性dsDNA文庫，接頭序列符合下列之一：
單index：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-Insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'
雙index：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'
線性dsDNA文庫插入片段范圍為 100 ~ 500 bp,，同時主帶集中在±100 bp 以內(nèi),。
2.2 樣本量要求
根據(jù)文庫總量選擇合適的線性dsDNA投入量，詳見表1：
表1 線性dsDNA總量與濃度要求
線性dsDNA文庫投入量(ng) | 線性dsDNA文庫總量(ng) | 線性dsDNA文庫濃度要求(ng/μl) |
10 | ≤25 | ＞0.45 |
25 | 25＜文庫總量＜50 | 1＜文庫濃度＜2.1 |
50 | ＞50 | ＞2.1 |
2.3 轉換PCR
不同線性 dsDNA 文庫投入量,，所需 PCR 循環(huán)也不相同,，詳見表2：
表2 不同線性dsDNA投入量PCR循環(huán)數(shù)推薦表
線性dsDNA文庫投入量(ng) | 推薦PCR循環(huán)數(shù) |
10 | 8 |
25 | 7 |
50 | 6 |
2.4 轉換文庫pooling要求
1. 不推薦在轉換PCR前對線性dsDNA進行pooling。
2. 需將接頭轉換 PCR 產(chǎn)物混合測序,，則 Sample Barcode Pooling 應遵循堿基平衡的原則：最佳平衡狀態(tài) ATGC 4種堿基的占比應分別為 25% ,，若不能達到 25%，則要保證每個 cycle 都存在 ATGC 四種堿基序列,，并且最少的堿基不應低于 12.5%,，最多的堿基不應高于 62.5%。
3. 不同片段長度的文庫不建議 pooling 環(huán)化,。
4. 若樣本所需數(shù)據(jù)量相同且長度相同,，則可以等量混合，每個樣本所需的質(zhì)量按照公式1進行計算：
公式1混合樣本中單個樣本所需質(zhì)量的計算
單個樣本所需的質(zhì)量 (ng)=1 pmol Input DNA 對應的質(zhì)量 (ng）/混合的樣本個數(shù) N
5. 混合后接頭轉換 PCR 產(chǎn)物總量為 1 pmol,，總體積最多為 40 μL,；若文庫不足則用 TE buffer補充至 40 μL
三、關于磁珠純化（Bead-based Clean Up）
1. 磁珠使用前應先平衡至室溫,，否則會導致純化得率下降,。
2. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。
3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應現(xiàn)用現(xiàn)配,，否則將影響回收效率,。
4. 產(chǎn)物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應,；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率,。通常情況下，室溫干燥約5 min,。
5. 單鏈環(huán)產(chǎn)物純化保存,，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于-20°C可保存1個月,。
四,、關于文庫質(zhì)檢（Library Quality Analysis）
1. 轉換文庫推薦使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 或 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit 等雙鏈 DNA 進行定量， 要求最終接頭轉換 PCR產(chǎn)物的摩爾產(chǎn)量至少為 1 pmol,，可根據(jù)公式2計算或參考表2,。
公式2 PCR 產(chǎn)物摩爾數(shù)與質(zhì)量間的換算
1 pmol PCR 產(chǎn)物對應的質(zhì)量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66
表3 不同片段大小PCR產(chǎn)物1 pmol對應產(chǎn)量
PCR產(chǎn)物主片段大?。╞p） | 1 pmol對應產(chǎn)量（ng） |
300 | 198 |
350 | 231 |
400 | 264 |
450 | 297 |
500 | 330 |
2. 單鏈環(huán)產(chǎn)物純化后推薦使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 單鏈 DNA 熒光染料試劑對純化后產(chǎn)物進行定量。
3. 單鏈環(huán)狀 DNA 產(chǎn)物純化后產(chǎn)量應達到 60 fmol 以上方足夠一次上機測序的量,，可根據(jù)公式3計算或參考表3 ,。
公式 3 單鏈環(huán)摩爾數(shù)與質(zhì)量間的換算
60 fmol 單鏈環(huán)對應的質(zhì)量 (ng)=0.06×DNA 主片段大小 (bp)×0.33
表4 不同PCR產(chǎn)物片段大小對應60 fmol單鏈環(huán)產(chǎn)量
PCR產(chǎn)物主片段大小（bp） | 60 fmol對應產(chǎn)量（ng） |
300 | 5.94 |
350 | 6.93 |
400 | 7.92 |
450 | 8.91 |
500 | 9.90 |
使用方法
一,、自備材料
1. 純化磁珠：Cat#12601,，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品,。
2. 文庫質(zhì)控：Cat#12640,，dsDNA HS Assay Kit for Qubit®或Cat#12642，1×dsDNA HS Assay kit for Qubit®或其他等效產(chǎn)品,。
3. 單鏈環(huán)質(zhì)控：Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit® ssDNA Assay Kit或其他等效產(chǎn)品,。
3. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水,、TE Buffer（10 mM Tris-HCl,，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管,、PCR管,、磁力架、PCR儀等,。
二,、操作流程
圖1 通用文庫轉換流程
三、操作步驟
Part A接頭轉換PCR
1.轉換PCR
該步驟對線性dsDNA文庫進行轉換-轉化為可以進行后續(xù)環(huán)化的線性dsDNA文庫,。
將表5中試劑解凍后顛倒混勻,，置于冰上備用。
于無菌PCR管中配制表5所示反應體系,。
表5 轉換PCR擴增反應體系
名稱 | 體積（μL） |
AC-PCR Amplification Mix | 25 |
AC-PCR Primer Mix | 1 |
線性dsDNA 文庫 | |
ddH2O | |
Total | 50 |
3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底,。
4. 將PCR管置于PCR儀中,，設置表6所示反應程序，進行PCR擴增,。
表6 PCR擴增反應程序
溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
98°C | 1 min | 1 |
98°C | 10 sec | 參照注意事項中表2 |
60°C | 30 sec | |
72°C | 30 sec | |
72°C | 5 min | 1 |
4°C | Hold | - |
2,、轉換PCR產(chǎn)物純化
1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min,。配制80%乙醇,。
2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×,，Beads : DNA=0.9:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中,，室溫孵育5 min,。
4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移除上清,。
5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,，室溫孵育30 sec后,，小心移除上清。
6. 重復步驟5,，總計漂洗兩次,。
7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）,。
8. 將PCR管從磁力架中取出,，進行洗脫：加入32 μL TE buffer，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,，室溫靜置5 min,。
9. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min）,，小心轉移30 μL上清至干凈的管中,。
3、轉換PCR產(chǎn)物質(zhì)檢
使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 等轉換PCR產(chǎn)物進行定量,，具體請參見注意事項四,。
Part B 轉換文庫環(huán)化
1 變性
1. 根據(jù)文庫長度，取1 pmol 至 0.2 ml PCR 管中,，用 TE Buffer 補充至總體積 40 μL,。
4. 混勻后，在 PCR 儀上進行 98℃變性 3 min,，之后立即置于冰上,，冰浴 2 min 后瞬時離心。
2 單鏈環(huán)化
1. 將表7中各試劑解凍后,，顛倒混勻,，置于冰上備用。
2. 于冰上配制表7反應體系,。
表7 單鏈環(huán)化體系
名稱 | 體積（μL） |
上一步反應物 | 40 |
App-A Splint Buffer | 15 |
Ligase | 5 |
Total | 60 |
3.使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻,，并短暫離心將反應液離心至管底。
4. 將PCR管置于PCR儀上,，按照表8所示攝制反應程序,，進行單鏈環(huán)化反應。
表8 單鏈環(huán)化反應程序
溫度 | 時間 |
熱蓋105°C | OFF |
37°C | 15 min |
4°C | Hold |
3 酶切消化
1. 將表9中各試劑解凍后,，顛倒混勻,，置于冰上備用,。
2. 于冰上配制表9所示反應體系。
表9 酶切消化體系
名稱 | 體積（μL） |
上一步反應物 | 60 |
Digestion Buffer | 8 |
Digestion Enzyme | 2 |
Total | 70 |
3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻,，并短暫離心將反應液離心至管底,。
4. 將PCR管置于PCR儀上，按照表10的條件進行反應：
表10 酶切消化反應程序
溫度 | 時間 |
熱蓋105°C | OFF |
37°C | 10 min |
4°C | Hold |
5. 反應結束后,，瞬時離心,，立即進行純化。
4 消化產(chǎn)物純化
該步驟使用磁珠對3.3步驟的產(chǎn)物進行純化,。
1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出,，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇,。
2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻,。
3. 吸取120 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads至消化產(chǎn)物中，室溫孵育10min,。
4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,，待溶液澄清后（約2 min），小心移除上清,。
5. 保持PCR管始終置于磁力架中,，加入500μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后,，小心移除上清,。
6. 重復步驟5，總計漂洗兩次,。
7. 保持PCR管始終置于磁力架中,，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂。
8. 將PCR管從磁力架中取出,，加入22 μL TE Buffer,，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置10 min,。
9. 短暫離心,，將 PCR 管始終置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約 2min）,，將上清小心移至新 PCR 管中， -20℃保存,，待制備 DNB,。
5 消化產(chǎn)物質(zhì)控
使用Qubit® ssDNA Assay Kit熒光試劑對酶切消化產(chǎn)物進行定量，具體請參見注意事項四,。
HB220117
