產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff NGS^® OnePot Pro PCR-Free DNA Library Prep Kit for Illumina^®是針對Illumina^®高通量測序平臺(tái)專業(yè)開發(fā)設(shè)計(jì)的新一代酶切法建庫試劑盒,。與傳統(tǒng)的建庫法比較，本品采用高質(zhì)量的片段化酶,，擺脫了繁瑣的超聲過程,，同時(shí)簡化了操作流程，將片段化模塊與末端修復(fù)模塊合二為一,，極大的降低了建庫的時(shí)間和成本,。本試劑盒具有優(yōu)秀的文庫轉(zhuǎn)化率，可應(yīng)用于常規(guī)動(dòng)植物基因組,、微生物基因組等樣本,，同時(shí)能兼容FFPE DNA樣本的建庫。改進(jìn)版試劑盒使用了新的優(yōu)化的連接酶,，極大的改善了接頭連接時(shí)的片段自連現(xiàn)象,。
適用500 pg - 1 μg的基因組DNA、全長cDNA等樣本
高質(zhì)量片段化酶,，可隨機(jī)切割雙鏈DNA,，酶切片段無偏好性
片段化、末端修復(fù)/加A一步完成
適用于FFPE DNA樣本
嚴(yán)格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸,。所有組分-20°C保存,，有效期1年,。

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康,，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻,，短暫離心后置于冰上待用,。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時(shí)使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫產(chǎn)出下降,。

4. 為避免樣品交叉污染,，使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時(shí)請更換槍頭,。

5. 在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng),，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染,，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性,。將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；使用移液器等設(shè)備,；并定時(shí)對各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理）,，以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

二,、關(guān)于DNA---片段化

1. 本試劑盒兼容范圍為500 pg - 1 μg Input DNA,。應(yīng)盡可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。

2. 若Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽,，可能會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn),，建議將DNA稀釋在TE（10 mM Tris-HCl ,1 mM EDTA，pH 8.0）中進(jìn)行片段化,。

3. 對于常規(guī)的高質(zhì)量基因組DNA,，酶切時(shí)間參考表4，本試劑盒片段化偏好低,，耐受各種GC含量的模板,。對于不同降解程度的FFPE樣本，酶切時(shí)間參考表5,。以上為時(shí)間,，需客戶在自己的實(shí)驗(yàn)體系中進(jìn)行微調(diào)，以達(dá)到好效果,。

4.為保證優(yōu)質(zhì)精確的片段化效果,，片段化反應(yīng)配制過程請于冰上操作。

5. 針對FFPE DNA建庫,，若樣本質(zhì)量不佳,，客戶對當(dāng)前建庫產(chǎn)量不滿意,，可選購我公司的FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606)對FFPE DNA進(jìn)行修復(fù)，具體使用方法可參考此產(chǎn)品說明書,。該試劑可與片段化末修加A過程同時(shí)進(jìn)行,，無需額外的操作。

三,、關(guān)于接頭連接（Adapter Ligation）

1. 針對Illumina^®測序平臺(tái),，Yeasen提供48種Barcoded Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；單端 96種 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12611~Cat#12612）,；雙端384 種UDI Primers: Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^®（Cat#12404~Cat#12407）,。

2. Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產(chǎn)量。Adapter用量過高可能會(huì)產(chǎn)生較多Adapter Dimer,；用量較低可能會(huì)影響連接效率及文庫產(chǎn)量,。表1列舉了使用本試劑盒，不同Input DNA量的Adapter使用量,。

表1  500 pg-1 μg Input DNA的Adapter使用濃度

【注】：Input DNA摩爾數(shù)（pmol）≈ Input DNA質(zhì)量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度（bp）],。

四、關(guān)于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. DNA---片段長度分選步驟可選擇在末端修復(fù)/dA尾添加之前,，或接頭連接后,，或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行。

2. 當(dāng)Input DNA質(zhì)量≥50 ng,，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質(zhì)量<50 ng,，建議您在文庫擴(kuò)增后進(jìn)行分選,。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會(huì)對雙輪分選產(chǎn)生顯著影響,。因此,，如在接頭連接后進(jìn)行長度分選，必須先純化步驟,，再進(jìn)行雙輪分選步驟,；如在末端修復(fù)/dA尾添加之前或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行長度分選，可直接進(jìn)行雙輪磁珠分選步驟,。

4. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫,，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳,。

5. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻,。

6. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請勿吸取磁珠,，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量,。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配,，否則將影響回收效率。

8. 進(jìn)行長度分選時(shí),，初始樣品體積應(yīng)盡量≥100 μL,，不足時(shí)請用超純水補(bǔ)齊。以防因樣品體積太小導(dǎo)致移液誤差增大,。

9. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥,。干燥不充分容易造成無水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率,。通常情況下,，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

10. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存,，可使用TE Buffer洗脫,，產(chǎn)物可于4°C可保存1-2周，-20°C可保存1個(gè)月,。

六,、關(guān)于文庫質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進(jìn)行質(zhì)量評價(jià),。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法,，如Qubit^®、PicoGreen^®等,；基于qPCR定量的方法,。

3. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop^®等,。

4. 使用qPCR方法進(jìn)行文庫濃度檢測：Qubit^®,、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時(shí)，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物,、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物,；qPCR定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫）,，可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫干擾,。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測,。

使用方法

一,、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880,，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品,。

2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。

3. DNA Adapter：Yeasen提供48種Barcoded Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；單端 96種 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12611~Cat#12612）,；雙端384 種UDI Primers: Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^®（Cat#12404~Cat#12407）,。或其他等效產(chǎn)品,。

4. 其他材料：無水乙醇,、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl,，1 mM EDTA ,，pH 8.0）、低吸附EP管,、PCR管,、磁力架、PCR儀等,。

二,、操作流程

圖1.OnePot Pro PCR-Free DNA建庫試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1 DNA----片段化/末端修復(fù)/dA尾添加（DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing）

該步驟將基因組DNA---片段化,，同時(shí)進(jìn)行末端修復(fù)及dA尾添加,。

1. 將表2中各試劑解凍后，顛倒混勻,，置于冰上備用,。

2. 于冰上配制表2反應(yīng)體系。

表2.DNA---片段化/末端修復(fù)/dA尾添加 PCR反應(yīng)體系

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻,，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底,。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表3所示反應(yīng)程序,，進(jìn)行DNA---片段化,，末端修復(fù)及dA尾添加反應(yīng),。

表3  DNA---片段化/末端修復(fù)/dA尾添加 PCR反應(yīng)程序

【注】：*DNA---片段化過程為有效控制片段化效果,，避免過度酶切,，反應(yīng)程序可預(yù)先設(shè)置4°C,，待模塊溫度降至4°C時(shí),，將PCR管放入PCR儀即可,。**對于完整的基因組DNA,，酶切時(shí)間參考表4,，Input DNA 500-1000 ng,，可根據(jù)需求，適當(dāng)延長酶切時(shí)間2-4 min左右,；對于質(zhì)量不一的FFPE DNA樣本,，酶切時(shí)間參考表5。

表4.常規(guī)基因組DNA---片段化時(shí)間選擇表表

表5.FFPE DNA---片段化時(shí)間選擇表

【注】：*DIN為DNA Integrity Number，是用Agilent 2200來定義FFPE DNA降解程度的一種方法,，詳見圖2,。

圖2.Agilent 2200定義不同降解程度樣本的DIN值

3.2 接頭連接（Adapter Ligation）

該步驟將3.1步驟的產(chǎn)物末端，連接特定的Illumina^®接頭,。

1. 根據(jù)Input DNA量按表1稀釋Adapter至合適濃度,。

2. 將表6中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用,。

3. 于3.1步驟PCR管中配制表6所示反應(yīng)體系,。

表6.Adapter Ligation PCR體系

【注】：*Ligation Enhancer比較粘稠，請上下顛倒,、振蕩,，充分混勻并瞬時(shí)離心后使用。

**本公司接頭濃度與常規(guī)商業(yè)化試劑盒一致,，皆為15 μM,。

【接頭添加計(jì)算舉例】：當(dāng)Input DNA為100 ng，Input DNA長度為300 bp時(shí),，接頭應(yīng)該添加多少,？

第一步：計(jì)算Input DNA摩爾數(shù)。公式：Input DNA摩爾數(shù)（pmol）≈ Input DNA質(zhì)量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度（bp）],；

Input DNA摩爾數(shù)（pmol）=100÷（0.66×300）=0.5 pmol,；

第二步：計(jì)算接頭添加摩爾數(shù)。根據(jù)注意事項(xiàng)三表1查詢接頭添加比例,；

根據(jù)表1,，查得Input DNA 100 ng時(shí)接頭添加比例100:1，則接頭添加摩爾數(shù)=100×0.5 pmol=50 pmol,；

第三步：計(jì)算接頭添加體積,。接頭濃度=15 μmol/L（如使用其他接頭，濃度需要依據(jù)其他接頭濃度參數(shù)）,；

接頭添加體積=接頭添加摩爾數(shù)（50 pmol）÷接頭濃度（15 μmol/L）=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL）

綜上,，接頭可添加3.4 μL，加1.6 μL水補(bǔ)齊至5 μL,。（注：接頭加入體積不超過5 μL）,。

4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底,。

5. 將PCR管置于PCR儀中,，設(shè)置表7所示反應(yīng)程序，進(jìn)行接頭連接反應(yīng),。

表7.Adapter Ligation PCR反應(yīng)程序

【注】：當(dāng)Input DNA量較低,，實(shí)驗(yàn)效果不理想時(shí),，可嘗試將連接時(shí)間延長一倍。

3.3 連接產(chǎn)物磁珠純化（Post Ligation Clean Up）

該步驟使用磁珠對3.2步驟的產(chǎn)物進(jìn)行純化或分選,。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無效產(chǎn)物,。

3.3.1 純化操作步驟：

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min,。配制80%乙醇,。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×,，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中,，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中,，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,，室溫孵育30 sec后，小心移除上清,。

6. 重復(fù)步驟5,，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中,，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）,。

8. 將PCR管從磁力架中取出，進(jìn)行洗脫：

1）如產(chǎn)物無需進(jìn)行片段分選,，直接加入21 μL ddH₂O,，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min,?！咀ⅲ喝缂兓a(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】,。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,，待溶液澄清后（約5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中,，切勿觸碰磁珠,。

2）如產(chǎn)物需進(jìn)行雙輪分選，加入102 μL ddH₂O,，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min,?！咀ⅲ喝缂兓a(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠,。

3.3.2 雙輪分選操作步驟：

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,，室溫平衡約30 min。配制80%乙醇,。

2. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻,。

3. 根據(jù)DNA---片段長度要求，參考表8向上述100 μL DNA上清中加入第一輪分選磁珠,，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻,。

表8.磁珠文庫分選比例

【注】：表中“×"表示樣品DNA體積。如文庫插入片段長度為250 bp,，樣品DNA體積為100 μL,，則第一輪分選磁珠使用體積為0.70×100 μL=70 μL,；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL,；表中所比例是針對于Adapter Ligated Insert DNA（Post Ligation）,，如果用戶在接頭連接前進(jìn)行分選，請采用Hieff NGS® DNA Selection Beads（Cat#12601）說明書中的比例,。

4. 室溫孵育5 min,。

5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min）,，小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中,。

6. 參考表8向上清中加入第二輪分選磁珠,。

7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻,，室溫靜置5 min。

8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移除上清,。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,，室溫孵育30 sec,，小心移除上清,。

10. 重復(fù)步驟9。

11. 保持PCR管始終處于磁力架中,，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）,。

12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH₂O,，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻,，室溫靜置5 min。

13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,。待溶液澄清后（約5 min）,，小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中。

3.4 文庫質(zhì)量控制

通常情況下,，構(gòu)建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進(jìn)行質(zhì)量評價(jià),，具體請參見注意事項(xiàng)六。

3.5 參考實(shí)例

使用Hieff NGS^® OnePot Pro PCR-Free DNA Library Prep Kit for Illumina^®對200 ng Human gDNA (NA12878) 樣本進(jìn)行酶切建庫檢測，片段化結(jié)果見圖3,。

圖3.OnePot Pro PCR Free DNA建庫試劑盒酶切200 ng Human gDNA樣本（不同酶切時(shí)間片段化效果檢測）

HB210203