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Plant Tissue Direct PCR Kit (With Dye)  

植物組織直接pcr試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

植物組織直接pcr試劑盒是一款可直接對(duì)不同類型植物葉片和種子進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑盒，適應(yīng)性廣,、穩(wěn)定性強(qiáng),。試劑盒采用*的裂解緩沖液體系，可以快速的裂解多種植物樣品并釋放出基因組DNA,，不需要除去蛋白,、RNA或次生代謝產(chǎn)物等，即可將釋放出的基因組DNA作為模板直接用于PCR反應(yīng),。此外,，樣品使用量少，低至1 mm植物葉片或種子即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。

本試劑盒中提供的2× Plant Master Mix具有很強(qiáng)的擴(kuò)增兼容性,，能直接以待測(cè)樣品裂解液為模板，進(jìn)行高效特異性擴(kuò)增,。該試劑為2倍濃縮PCR反應(yīng)混合液,，包含了用于PCR擴(kuò)增除模板和引物外的所有組分，大大簡(jiǎn)化操作過(guò)程,，降低污染幾率,。

該試劑盒可用于轉(zhuǎn)基因植株鑒定、植物基因分型等,。

產(chǎn)品組分

a）2× Plant Master Mix：包含熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶,、dNTP混合物、MgCl₂,、反應(yīng)緩沖液,、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑等,，同時(shí)包含電泳Loading Buffer, PCR完成之后可直接電泳,。

運(yùn)輸方法

冰袋運(yùn)輸。

保存方法

1. 試劑10187-A【Buffer P1】,，置于4℃保存,。

2. 試劑10187-B【Buffer P2】,，中和裂解產(chǎn)物,，利于更長(zhǎng)時(shí)間保存樣本,，置于4℃保存。

3. 試劑10187-C【2 × Plant Master Mix】,，-20℃保存,，避免反復(fù)凍融。

操作方法

植物葉片

研磨裂解法：

①研磨儀破碎：將直徑5 mm左右的葉片置于50 μL Buffer P1中,，用研磨儀加鋼珠（鋼珠直徑3mm左右,，共2個(gè)）破碎葉片（45 Hz，1 min）,，葉片破碎后溶液呈現(xiàn)綠色,，瞬時(shí)離心，上清液請(qǐng)放在4℃?zhèn)溆?，?/span>1 μL用于PCR擴(kuò)增,。

②槍頭搗碎：推薦使用幼嫩葉片。將直徑5 mm左右的葉片置于50 μL Buffer P1中,，用槍頭將葉片搗碎,，搗碎后溶液呈現(xiàn)綠色，瞬時(shí)離心,，上清液請(qǐng)放在4℃?zhèn)溆?，?/span>1 μL用于PCR擴(kuò)增。

加熱裂解法：推薦使用幼嫩葉片,。將直徑5 mm左右的葉片置于50 μL Buffer P1中,，95℃加熱5-10 min（確保裂解液*浸沒(méi)葉片），較難裂解的葉片（老葉片）可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間（10-20 min）,，加熱裂解后溶液呈現(xiàn)綠色,，震蕩混勻，瞬時(shí)離心,，上清液請(qǐng)放在4℃?zhèn)溆?，?/span>1 μL用于PCR擴(kuò)增。

直接法：推薦使用幼嫩葉片,。使用打孔器或者刀,，將直徑1 mm左右的葉片直接加入到PCR反應(yīng)體系中；復(fù)雜樣本或者是長(zhǎng)片段的擴(kuò)增,，推薦使用直徑<1mm的葉片,。

植物種子

加熱裂解法：用刀或者堅(jiān)硬的物體取直徑約1 mm左右的種子，將其置于50 μL Buffer P1 中95℃加熱5-10 min,，較難裂解的種子可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間（10-20 min）,，加熱后震蕩混勻，瞬時(shí)離心,，底部呈現(xiàn)透明的糊狀,，上清液請(qǐng)放在4℃?zhèn)溆?，?/span>1 μL上清液用于PCR擴(kuò)增。

直接法：用刀或者堅(jiān)硬的物體取直徑約1 mm左右的種子,，將其置于50 μL Buffer P1（Buffer P1需要提前室溫下平衡20 min）中,，用槍頭或者其他的方式搗碎種子，種子搗碎后溶液呈現(xiàn)乳白色,，室溫靜置15 min,，震蕩混勻，瞬時(shí)離心,，上清液請(qǐng)放在4℃?zhèn)溆?，? μL上清液用于PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系

【注】：各組分使用前應(yīng)充分混勻,。

a）模板加入量：小于PCR反應(yīng)體系的5%,，過(guò)多會(huì)嚴(yán)重抑制PCR反應(yīng)，強(qiáng)烈推薦加入1 μL模板,。葉片直擴(kuò)優(yōu)先推薦研磨儀裂解法,，種子直擴(kuò)優(yōu)先推薦加熱法。

b）引物終濃度：0.2-0.25 μM可以得到較好結(jié)果,。反應(yīng)性能較差時(shí),，可在0.1-0.5 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。

c）反應(yīng)體系：推薦使用20 μL或50 μL,，以保證目的基因擴(kuò)增的有效性和重復(fù)性,。

d）體系配制：配制好PCR反應(yīng)體系，置于渦旋儀上渦旋混勻,，瞬時(shí)離心將反應(yīng)液集于管底,。

e）對(duì)照反應(yīng)：建議進(jìn)行PCR時(shí)，設(shè)置陽(yáng)性和陰性PCR對(duì)照反應(yīng)以便于排除假陽(yáng)性或假陰性的干擾,。

f）為了更穩(wěn)定的保存裂解后的模板,，將轉(zhuǎn)移出來(lái)的上清液，按照裂解產(chǎn)物（DNA模板）：Buffer P2 = 5:1的比例混合,，混勻后-20℃保存,，穩(wěn)定保存隨時(shí)間和樣本狀態(tài)不同而有所不同。如果處理后的植物葉片或種子上清液一周內(nèi)用于PCR擴(kuò)增,，不用加Buffer P2,，上清液請(qǐng)保存在-20℃。

PCR反應(yīng)條件

【注】：a）退火溫度：請(qǐng)參考引物的理論 Tm 值,，退火溫度可設(shè)置低于引物理論值 2-5℃,。

b）延伸時(shí)間：需要根據(jù)片段的長(zhǎng)度來(lái)確定，對(duì)于1 kb以內(nèi)的DNA///片段,，建議延長(zhǎng)時(shí)間為1 min,。

注意事項(xiàng)

1. 做葉片實(shí)驗(yàn)時(shí),，建議使用新鮮采取的葉片組織，若為長(zhǎng)期冷凍組織,，需-80℃保存,，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融,，以免造成模板降解,，影響PCR效率。葉片組織以幼嫩為宜,，若為成熟的葉片,，避免使用葉片主脈部位組織；做種子實(shí)驗(yàn)時(shí),，不要用發(fā)霉的種子,，發(fā)霉的種子很可能導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。

2. 建議擴(kuò)增片段長(zhǎng)度1 kb以內(nèi),，以便擴(kuò)增效率///佳,。

3. 取樣時(shí)使用打孔器或者刀取適宜大小的樣本，樣本不同時(shí),，打孔器或者刀每次處理樣本前需清洗干凈,。

4. 對(duì)于葉片組織，建議取1-10 mm的葉片,，過(guò)小會(huì)使PCR擴(kuò)增產(chǎn)量低,，過(guò)多會(huì)抑制PCR反應(yīng)，采用加熱裂解法,、槍頭搗碎,、研磨儀破碎的方式處理植物葉片，處理后需震蕩離心,，務(wù)必取上清液試驗(yàn),，沉淀會(huì)嚴(yán)重抑制PCR反應(yīng)；對(duì)于種子組織,，取1-3 mm的種子,，過(guò)小會(huì)使PCR擴(kuò)增產(chǎn)量低，過(guò)多會(huì)嚴(yán)重抑制PCR反應(yīng),，采用加熱裂解法裂解種子,，處理后震蕩離心，務(wù)必取上清液試驗(yàn),，沉淀會(huì)嚴(yán)重抑制PCR反應(yīng),。

5.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作,。

常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法

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