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Kinetic Turbidimetric LAL Assays

動(dòng)態(tài)濁度法內(nèi)毒素檢測鱟試劑

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

鱟試劑為鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的冷凍干燥品,，鱟試劑中含有C因子,、B因子,、凝固酶原,、凝固蛋白原等。

動(dòng)態(tài)濁度法內(nèi)毒素檢測鱟試劑（Kinetic Turbidimetric LAL Assays）是通過檢測反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間,，或是檢測濁度增加速度來檢測內(nèi)毒素的方法,。在適宜的條件下（溫度，pH值及無干擾物質(zhì)）,，細(xì)菌內(nèi)毒素激活C因子,，引起一系列酶促反應(yīng)，使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠,。隨著凝膠的形成,，反應(yīng)液的吸光度(OD值，濁度)增加,，OD值增加的速度與內(nèi)毒素濃度成正相關(guān),。換言之，OD值上升某一預(yù)設(shè)限值(啟動(dòng)OD)所需要的時(shí)間(定義為啟動(dòng)時(shí)間)與內(nèi)毒素濃度成負(fù)相關(guān),，啟動(dòng)時(shí)間的對數(shù)與內(nèi)毒素濃度的對數(shù)成線性關(guān)系,，據(jù)此，可以定量供試品的內(nèi)毒素濃度,。

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸,。4ºC，避光保存,，有效期兩年,。

注意事項(xiàng)

1）該試劑盒用于體外細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測，嚴(yán)禁試劑以任何途徑進(jìn)入機(jī)體,。

2）接觸試劑及供試品的所有器皿必須是除熱原的,。試驗(yàn)過程應(yīng)防止微生物的污染。

3）該說明書中的除熱原指內(nèi)毒素濃度小于0.005 EU/ml。

4）供試品的pH 值應(yīng)在6.0-8.0之間,，若超出此范圍,，需用除熱原的緩沖液、0.1 M氫氧化鈉或0.1M鹽酸調(diào)節(jié),。

5）當(dāng)供試品中可能存在鱟試驗(yàn)的干擾物質(zhì)時(shí),，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)，參見【供試品的干擾試驗(yàn)】,。

所需材料和設(shè)備

1. 試劑：內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品,、鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水,。

2. 器材：

除熱原試管,、除熱原吸頭、除熱原加樣槽,、除熱原96孔微板,。

旋渦混合器、移液器,、多道移液器,、試管架。

帶溫育系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)光度測定儀器及配套軟件,，例如,，微板鱟試儀ELx808及軟件TALgent 或Gen5。

操作方法

1. 動(dòng)態(tài)光度測定儀器的設(shè)定,，以微板鱟試儀ELx808為例：

預(yù)熱儀器,，設(shè)置溫育溫度為37℃。

設(shè)置模板及程序,。

設(shè)定讀板波長為340nm,、630nm，設(shè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)：讀板90-120分鐘,， 每讀板間隔30-150s,。

2. 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線所采用的內(nèi)毒素濃度可以為2至10倍稀釋的系列(如0.5，0.25,，0.125,，0.0625EU/ml 或10，1,，0.1,，0.01EU/ml))。

2）取內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支,，用砂輪沿安瓿頸部劃痕,，開啟,，加入適量（建議在0.5 ml-1.2 ml之間）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，置旋渦混合器上劇烈振搖5分鐘,。

3）將上述內(nèi)毒素溶液進(jìn)一步用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成所需濃度,，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上劇烈振搖1分鐘。

稀釋的內(nèi)毒素溶液靜置時(shí)間超過10分鐘,，用前在旋渦混合器上劇烈振搖1分鐘,，配置時(shí)間超過4小時(shí)的內(nèi)毒素溶液應(yīng)丟棄。(參見《內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品使用說明書》),。

3. 陰性對照為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水,。

4. 鱟試劑的溶解：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于鱟試劑中，輕輕振搖使鱟試劑*溶解,。注意不要用旋渦混合器劇烈振搖,。溶解的鱟試劑應(yīng)在10分鐘內(nèi)使用。

若采用多道移液器,，將溶解的鱟試劑轉(zhuǎn)移到除熱原加樣槽，并輕輕搖勻,。

5. 實(shí)驗(yàn)操作（微板鱟試儀ELx808）：

1）取除熱原微板,，在各孔中分別加入100μl細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,，或供試品,。

2）將微板放置于鱟試儀中，37℃溫育10分鐘,。

3）溫育結(jié)束,，用移液器或多道移液器加入100μl 鱟試劑（避免產(chǎn)生氣泡!)，中速振搖10 秒混勻,，在340nm波長處,，每30秒（到60秒）讀一次，讀板120分鐘,。

數(shù)據(jù)處理

設(shè)定啟動(dòng)OD(可以設(shè)為0.02, 一般可以在0.02到0.04之間),，軟件自動(dòng)給出其啟動(dòng)時(shí)間(T)。

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：lgT = b lgC + a,，其中T為啟動(dòng)時(shí)間,，C為內(nèi)毒素的濃度，b為直線斜率,，a為Y軸截距,。

當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同時(shí)滿足如下三個(gè)條件時(shí)實(shí)驗(yàn)才有效：

① 標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度點(diǎn)≥ 3，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r ≤ -0.980,，

② 標(biāo)準(zhǔn)曲線低點(diǎn)的T值小于陰性對照的T值,，

③ 供試品平行管的平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的區(qū)間內(nèi),。

【供試品的干擾試驗(yàn)】

① 當(dāng)對新藥或無內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，必須進(jìn)行干擾試驗(yàn),；

② 當(dāng)鱟試劑,、供試品的來源、配方,、生產(chǎn)工藝改變,，或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，必須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn),；

③ 當(dāng)供試品中可能存在鱟試驗(yàn)的干擾物質(zhì)時(shí),，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

步驟如下：,、

1）選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（設(shè)為λm）,，作為供試品干擾試驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度，如采用標(biāo)準(zhǔn)曲線為10,，1,，0.1，0.01EU/ml 系列時(shí), 可以用供試品配制0.1EU/ml 內(nèi)毒素濃度作為實(shí)驗(yàn)的供試品陽性對照,。

2）用供試品溶液配制濃度為λm 的內(nèi)毒素溶液（即含λm 內(nèi)毒素的供試品陽性對照）,，測量出該溶液的內(nèi)毒素濃度，稱為Cs,；

3）測量出未添加外源內(nèi)毒素的供試品溶液內(nèi)毒素濃度,，稱為Ct；

4）計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率R＝（Cs–Ct）/λm × 100%

5）當(dāng)R在50%～200%之間,，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在明顯干擾作用,。

6）當(dāng)R在50%～200%之外，需對供試品進(jìn)行系列稀釋或進(jìn)行其它處理消除干擾, 每一稀釋溶液都重復(fù)步驟2-4, 直到內(nèi)毒素的回收率R在50%～200%之間,。選擇回收率Rjie近100%的稀釋倍數(shù)進(jìn)行內(nèi)毒素檢測,。

(參見《中華人民共和國藥典》2010版中《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》)

HB191220