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SulfoLink Coupling Resin  巰基蛋白瓊脂糖偶聯(lián)樹脂

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

SulfoLink Coupling Resin是一類預活化樹脂,，其純化原理在于可以通過與巰基或者氨基的反應實現(xiàn)抗原的固定化,，進而利用抗原抗體的特異性反應對免疫血清中的抗體進行高效純化,，是多克隆抗體生產(chǎn)中*的純化介質,。

產(chǎn)品性質

運輸和保存方法

冰袋運輸,。4℃保存。

注意事項

1）SulfoLink Coupling Resin使用前一定要充分顛倒若干次,，使瓊脂糖珠混合均勻,。

2）所有操作過程中，樣本需要在4℃或冰上操作,。

3）為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

針對巰基和氨基的偶聯(lián)條件有所差異,，請分別進行選擇,。

1含巰基抗原的偶聯(lián)流程

1.1 緩沖液準備

所用水和 Buffer 在使用之前建議用0.22 μm或0.45μm濾膜過濾。

偶聯(lián)液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5

封閉液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, 50 mM L-半胱氨酸,，pH 8.5

保護液：20 mM PBS,，20%乙醇，pH 8.0

結合/洗雜液：20 mM PBS,，pH 8.0

洗脫液：100 mM 甘氨酸,，pH 2.5-3.0

中和液：1 M Tris-HCl, pH 8.5

1.2  抗原準備

使用偶聯(lián)液溶解抗原,，制備成終濃度為 1-3 mg/ml 的抗原溶液。建議該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配,，儲存時間過長會影響偶聯(lián)效果,。

【注】：① 抗原樣品使用前務必確保其巰基處于還原狀態(tài)（可以使用 DTNB(Ellman's Reagent), Yeasen Cat#60306）檢測自由巰基的含量）。如果巰基已經(jīng)氧化,，必須對抗原進行還原,，一般推薦使用還原劑 TCEP（Tris(2-carboxyethyl)phosphine, Yeasen Cat# 20330），TCEP 溶液很穩(wěn)定,，可以選擇性的,、高效的打開抗原中的二硫鍵，并且不影響抗原與樹脂的偶聯(lián)反應,，每毫克抗原中 TCEP 的添加量不超過12mg,，具體使用量需要自行優(yōu)化。

② 如果使用 DTT 等含有巰基的還原劑,，處理完樣品必須要將還原劑去除,，否則會影響抗原與樹脂的偶聯(lián)效率。

1.3抗原偶聯(lián)

1）取適量SulfoLink Coupling Resin,，加入到合適的重力柱中,，靠重力流干保護液，用3倍柱體積的偶聯(lián)液平衡樹脂,，待偶聯(lián)液流干,，再加入3倍柱體積的偶聯(lián)液，重復操作 2遍,。共使用9倍柱體積的偶聯(lián)液,。

2）關閉柱子的下端出口，加入等體積的含巰基的抗原,，混勻,，取出至合適的離心管中，置于28℃震蕩孵育30min,。

【注】：確保樹脂充分懸浮起來,，否則將大大影響偶聯(lián)效率。

3）將上述反應體系取出,，轉移至重力柱中,，流干其中溶液，并收集流出液,，再用3倍柱體積的偶聯(lián)液清洗樹脂,，合并兩次流出液。

【注】：如有需要,，可以使用 Ellman’s Reagent 檢測其中巰基含量,，得出抗原殘留量,，從而計算偶聯(lián)效率,。

4）關閉柱子的下端出口,，加入等體積的封閉液，混勻,，轉移至合適的離心管中,，于28℃震蕩孵育30min,。

5）將上述反應體系取出，轉移至重力柱中,，流干其中的封閉液,。

【注】：如果立即使用，可以參考【抗體純化】操作,。如果以后使用，可以用3倍柱體積的結合液清洗樹脂,，然后保存在等體積的保護液中,，于 4℃冰箱保存。

1.4  抗體純化

1）將偶聯(lián)了抗原的樹脂裝入合適的層析柱,，用5倍柱體積的結合液進行平衡,，使填料處于與抗體更易結合環(huán)境中，一方面保護目標抗體,，另一方面提高抗體結合效率,。

2）將含有抗體的樣品加到平衡好樹脂中，為了保證抗體與樹脂充分接觸,，提高目標抗體的回收率,，可以控制上樣流速在0.5-1 ml/min，并收集流出液,。

3）用10-15倍柱體積的洗雜液進行清洗,，去除非特異性吸附的雜蛋白，提高目的抗體的純度,，收集洗雜液,。

4）使用5-10倍柱體積的洗脫液，收集洗脫組分,，即目的抗體,。

【注】：為了保持抗體活性，需要立即將洗脫組分透析至pH 7.0-8.0的緩沖液中,，或者先加入1/10倍洗脫組分體積的中和液,，將洗脫組分進行中和，再透析,。

5）依次使用3倍柱體積的結合液和5倍柱體積的去離子水平衡樹脂,，zui后再用5倍柱體積的保護液平衡,，然后保存在等體積的保護液中，置于4℃保存,，防止填料被細菌污染,。

2  含氨基抗原偶聯(lián)流程

2.1 緩沖液準備

所用水和 Buffer 在使用之前建議用 0.22μm或0.45μm濾膜過濾。

偶聯(lián)液：0.1 M NaHCO₃,，0.5 M NaCl,，pH 8.5

封閉液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, 50 mM L-半胱氨酸，pH 8.5

保護液：20 mM PBS,，20%乙醇,，pH 8.0

結合/洗雜液：20 mM PBS，pH 8.0

洗脫液：100 mM 甘氨酸,，pH 2.5-3.0

中和液：1 M Tris-HCl, pH 8.5

2.2抗原偶聯(lián)

1）使用偶聯(lián)液溶解抗原,，制備成終濃度為5-10 mg/ml的抗原溶液。

2）取適量SulfoLink Coupling Resin,，加入到合適的重力柱中,，靠重力流干保護液，用3倍柱體積的偶聯(lián)液平衡樹脂,，待偶聯(lián)液流干,，再加入3倍柱體積的偶聯(lián)液，重復操作2遍,。共使用9倍柱體積的偶聯(lián)液,。

3）關閉柱子的下端出口，加入等體積的含氨基的抗原,，混勻,，取出轉移至合適的離心管中，置于 28℃震蕩孵育3-5h,，或者4℃震蕩孵育一個晚上（12-15h）,。

【注】：確保樹脂充分懸浮起來，否則將大大影響偶聯(lián)效率,。

4）將上述反應體系取出,，轉移至重力柱中，收集流出液,，再用3倍柱體積的偶聯(lián)液清洗樹脂,，合并兩次流出，待測試,。

5）關閉柱子的下端出口,，加入等體積的封閉液，混勻,，取出轉移至合適的離心管中,，置于28℃震蕩孵育30min,。

6）將上述反應體系取出，轉移至重力柱中,，流干其中的封閉液,。

【注】：如果暫不使用，可以用3倍柱體積的結合液清洗樹脂,，然后保存在等體積的保護液中,，于4℃保存。

2.3 抗體純化

1）將偶聯(lián)了抗原的樹脂裝入合適的層析柱,，用5倍柱體積的結合液進行平衡,，使填料處于與抗體更易結合環(huán)境中，一方面保護目標抗體,，另一方面提高抗體結合效率,。

2） 將含有抗體的樣品加到平衡好樹脂中，為了保證抗體與樹脂充分接觸,，提高目標抗體的回收率,，可以控制上樣流速在 0.5-1 ml/min，并收集流出液,。

3）用10-15 倍柱體積的洗雜液進行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白,，提高目的抗體的純度,，收集洗雜液。

4）使用5-10倍柱體積的洗脫液,，收集洗脫組分,，即目的抗體。

【注】：為了保持抗體活性,，需要立即將洗脫組分透析至pH7.0-8.0的緩沖液中,，或者先加入1/10倍洗脫組分體積的中和液，將洗脫組分進行中和,，再透析,。

5）依次使用3倍柱體積的結合液和5倍柱體積的去離子水平衡樹脂，zui后再用5倍柱體積的保護液平衡,，然后保存在等體積的保護液中,，置于4℃保存，防止填料被細菌污染,。

3  SDS-PAGE 檢測

將純化抗體樣品得到的流出組分,、洗雜組分和洗脫組分以及原始含抗體樣品使用SDS-PAGE檢測純化效果。

4 問題與解決方案

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