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Protein A/G Agarose Resin 4FF  蛋白A/G瓊脂糖快速純化樹脂

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

天然蛋白A（Protein A）是一種發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁表面蛋白,，天然蛋白G（Protein G）是一種分離自G型或C型鏈球菌屬的細(xì)胞表面蛋白，二者功能相似,，主要通過與免疫球蛋白（Ig）的Fc區(qū)相互作用,，可結(jié)合大多數(shù)哺乳動物的IgG,。然而兩者結(jié)合特異性上有所不同（詳細(xì)見附錄1,，蛋白A,，G對不同物種Ig的結(jié)合能力總表），如蛋白G對人IgG3,，大鼠IgG2a,，綿羊IgG1具有很高的親和力,，但蛋白A對這些Ig結(jié)合力很弱,。蛋白A,，蛋白G常共價偶聯(lián)在固體載體如瓊脂糖珠或丙烯酸樹脂小珠上,，直接用以做免疫沉淀（IP）或者免疫共沉淀（Co-IP）來進(jìn)行蛋白功能相關(guān)研究，或者直接裝在層析柱上來純化單克隆或者多克隆抗體,。

本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G,，不僅維持其本身的Ig親和特性,，同時也去除了天然蛋白本身的非主要結(jié)合域以降低非特異性結(jié)合,。本品同時將蛋白A和蛋白G共價偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠微球表面,，比單獨(dú)的蛋白A或者蛋白G都有更廣的結(jié)合范圍,，適合于所有蛋白A瓊脂糖珠和蛋白G瓊脂糖珠單獨(dú)可以結(jié)合的Ig，實(shí)用性更高,。

產(chǎn)品性質(zhì)

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸,。4℃保存，2年有效,。

需準(zhǔn)備試劑

【注】：建議以下緩沖液在使用前用0.22μm或0.45μm濾膜過濾,。

結(jié)合/洗雜緩沖液：0.15M NaCl, 20mM Na₂HPO₄, pH7.0

洗脫緩沖液：0.1M甘氨酸,，pH 3.0

中和液：1M Tris-HCl,，pH 8.5

交聯(lián)緩沖液：0.2M 三乙醇胺,，pH8.2

終止液：50mM Tris-HCl，pH 7.5

使用方法

一,、免疫沉淀（Immunoprecipitation,，IP）:

1蛋白樣品的準(zhǔn)備：

① 貼壁細(xì)胞：取10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞,，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液,，PBS洗滌2次,，然后加入500 μl至2 ml細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞（如RIPA裂解液）,；

② 懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞后,，PBS洗滌1次,，然后參考貼壁細(xì)胞的裂解方法進(jìn)行裂解,；

③ 動植物組織樣本：參考貼壁細(xì)胞使用裂解液的比例進(jìn)行裂解,；

【注意】：a）具體的裂解方法，應(yīng)參考不同裂解液的詳細(xì)使用方法,；b）不同量的細(xì)胞，應(yīng)選用適當(dāng)裂解液的用量進(jìn)行裂解（如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高,，可以用裂解液或PBS適當(dāng)稀釋,，如果蛋白樣品濃度過低,，在以后的裂解過程中宜適當(dāng)減少裂解液的用量）,，通常裂解液zui終總蛋白濃度選擇在0.5-1ug/ul范圍內(nèi)較合適,；c）可選：細(xì)胞或組織處理時加入廣譜核酸酶Benzonase（Yeasen Cat#20125）,，能夠降解所有形式的DNA和RNA(單鏈,、雙鏈、線形和環(huán)狀),，而無蛋白水解活性。此步操作可以降低背景,，保障實(shí)驗的可重復(fù)性,。

2 去除非特應(yīng)性結(jié)合（可選）：

① 取0.2-1 ml 細(xì)胞或組織裂解液,，蛋白量約為0.2-1 mg,，加入約1 μg和免疫沉淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG和20 μl充分重懸的Protein A/G Agarose Resin 4FF,，4℃緩慢搖動30 min~2 h。

② 2500 rpm（約1000g）離心5min,，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。

【注】：所謂種屬相同的IgG是指與后續(xù)免疫沉淀用一抗宿主相同的正常IgG,。此步驟可以預(yù)先去除樣本與Protein A/G Agarose Resin 4FF的非特異性結(jié)合,，降低背景,。

3 免疫沉淀：

1）抗體吸附

① 取適量Protein A/G Agarose Resin 4FF加入到2ml離心管中,，500rpm離心1min,，吸棄上清,。

② 加入0.5ml結(jié)合緩沖液重懸樹脂,，500rpm離心1min,，吸棄上清,。繼續(xù)重復(fù)2次此操作,。

③ 向上述已平衡樹脂中加入抗體溶液,，重懸樹脂,，室溫下輕輕翻轉(zhuǎn)離心管或置于翻轉(zhuǎn)混合儀混勻30min后,，500rpm離心1min,，收集上清液,，備用,，待檢測。

④ 向上述樹脂中加入0.5ml的洗雜緩沖液,，重懸樹脂對其進(jìn)行清洗,，去除非特異性吸附的雜蛋白,，500rpm離心1min，吸棄上清,。再重復(fù)2次。

2）抗體交聯(lián)（可選）

【注】：如需將抗體和目標(biāo)抗原復(fù)合物共同洗脫,，請忽略此步驟。

① 向清洗過的樹脂中加入1ml交聯(lián)Buffer,，500rpm離心1min,，吸棄上清。

② 再向其中加入1ml 20mM DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)的交聯(lián)Buffer,，該試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，重懸樹脂,，室溫下手動顛倒混勻或置于翻轉(zhuǎn)混合儀輕輕翻轉(zhuǎn)，促使Buffer 和樹脂充分接觸,，30min后，500rpm離心1min,，吸棄上清,。

③ 再向其中加入1ml終止液,，重懸樹脂,，終止交聯(lián)反應(yīng),，室溫下手動顛倒混勻或置于翻轉(zhuǎn)混合儀輕輕翻轉(zhuǎn)15min,，500rpm離心1min,，吸棄上清,。

④ 加入0.5ml洗雜緩沖液,，重懸樹脂,，進(jìn)行清洗,，500rpm離心1min，吸棄上清,。再重復(fù)2次。

3）沉淀反應(yīng)

① 抗原吸附：向上述樹脂-抗體溶液中加入含抗原的樣品,，用移液器輕輕吹打使抗原與樹脂-抗體復(fù)合物分散均勻,，室溫下手動顛倒混勻或置于翻轉(zhuǎn)混合儀輕輕翻轉(zhuǎn)10min,，使抗原與抗體充分結(jié)合,，如結(jié)合力較弱則可在室溫下反應(yīng)1h或者在4℃下反應(yīng)一個晚上。

② 洗雜：將上述完成抗原吸附的產(chǎn)物500rpm 離心1min,，收集上清液置于冰上待檢測,。向離心管中加入1ml洗雜緩沖液,，用移液器輕輕吹打使樹脂-抗體-抗原復(fù)合物分散均勻,，500rpm離心 1min,，棄上清,。重復(fù)2次,，zui后加入1ml洗雜液，將樹脂-抗體-抗原復(fù)合物轉(zhuǎn)移至新的離心管中,，500rpm離心1min,，吸棄上清。

4 樣品洗脫

【注】：根據(jù)后續(xù)檢測的不同提供兩種洗脫方法,。

1） 變性洗脫：該方法適于SDS-PAGE檢測,。向上述離心管中加入25μl 1×SDS-PAGE loading buffer 混勻,，95℃加熱5min,。500rpm 離心1min,，收集上清進(jìn)行后續(xù)WB分析,。

2）非變性洗脫：該法洗脫的樣品保持原有的生物活性,，可用于后續(xù)功能分析,。具體做法：向上述沉淀反應(yīng)得到的樹脂-抗體-抗原復(fù)合物中加入5倍體積的洗脫Buffer,，用移液器輕輕吹打數(shù)次,，室溫下手動顛倒混勻或置于翻轉(zhuǎn)混合儀輕輕翻轉(zhuǎn)10min,，500rpm離心1min,，吸取上清,，收集洗脫組分,，即為目標(biāo)抗原，將其收集至新的離心管中,，立即加入1/10體積的中和液,，將洗脫組分PH調(diào)至7.0-8.0,，備用,。

二、免疫共沉淀 （Co-IP）

1 抗原抗體的結(jié)合：將抗體與含有目的蛋白的裂解液混合,，室溫孵育30-60min,，或者4℃孵育一個晚上。

【注】：① 該步驟孵育時間取決于抗原與抗體的結(jié)合效率以及抗原的穩(wěn)定性,，需根據(jù)具體情況進(jìn)行優(yōu)化；② 抗體的加入量需參考后續(xù)加入樹脂的量,，抗體加入量過多會導(dǎo)致抗原-抗體混合物與樹脂的結(jié)合,。推薦抗體加入量為樹脂80%的zui大載量,。

2 樹脂準(zhǔn)備：

1）取適量Protein A/G Agarose Resin 4FF加入到2ml離心管中,，500rpm離心1min,，吸棄上清,。

2）加入0.5ml結(jié)合Buffer 重懸樹脂,，500rpm離心1min,，吸棄上清,。繼續(xù)重復(fù)2次此操作。

3 抗原-抗體混合物的吸附：將步驟1中抗原-抗體混合物加入到已處理的樹脂中,，混勻,，室溫下手動顛倒混勻或置于翻轉(zhuǎn)混合儀輕輕翻轉(zhuǎn)30min,，使其充分接觸并吸附,，500rpm離心1min,，收集上清留待檢測,。

4 洗雜：向上述離心管中加入0.5ml洗雜緩沖液，重懸樹脂,，去除非特異性結(jié)合,，500rpm離心1min，吸棄上清,。再重復(fù)2次此操作,。

5 抗原洗脫（根據(jù)后續(xù)檢測的目的提供兩種抗原洗脫方法，同免疫沉淀法洗脫）

注意事項

1）請勿冷凍保存本產(chǎn)品,。

2）Protein A/G瓊脂糖珠使用前一定要充分顛倒若干次,，使瓊脂糖珠混合均勻。

3）所有操作過程中,，樣本需要在4℃或冰上操作,。

4）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作,。

附錄  蛋白A,，G對不同物種Ig的結(jié)合能力總表（見下）

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