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Alamar Blue 阿爾瑪藍(lán)

產(chǎn)品信息

檢測原理

阿爾瑪藍(lán)（Alamar Blue）是一種氧化還原指示劑,，能根據(jù)代謝活性產(chǎn)生吸亮度變化和熒光信號,。這是一種安全無毒的染料,，可用于細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖的定量分析以及細(xì)胞因子生物測定和體外細(xì)胞毒性研究,，能有效測定動物,、真菌和細(xì)菌細(xì)胞的天然代謝活性。Alamar Blue在氧化狀態(tài)下呈現(xiàn)紫藍(lán)色無熒光性,，而在還原狀態(tài)下,，轉(zhuǎn)變?yōu)槌史奂t或紅色熒光的還原產(chǎn)物,，反映所研究的細(xì)胞或微生物對氧分子的消耗,，因而常被用作氧化還原指示劑,，以顯示被觀察細(xì)胞和細(xì)菌的代謝活動。這種測定是基于具有代謝活性的細(xì)胞將試劑轉(zhuǎn)換成熒光和比色指示劑的能力,。在細(xì)胞增殖過程中,，細(xì)胞內(nèi)NADPH/NADP、FADH/FAD,、FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高,，處于還原環(huán)境。攝入細(xì)胞內(nèi)的染料被這些代謝中間體及細(xì)胞色素類還原后釋放到細(xì)胞外并溶于培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基從無熒光的靛青藍(lán)變成有熒光的粉紅色,。受損和無活性細(xì)胞具有較低的天然代謝活性,，因此對應(yīng)的信號較低?？梢杂闷胀ǚ止夤舛扔嫽驘晒夤舛扔嫏z測,，其激發(fā)光波長在530-560 nm之間，發(fā)射光波長為590 nm,。吸光度和熒光強(qiáng)度與活性細(xì)胞數(shù)成正比,。

本品可廣泛地用于細(xì)胞增殖代謝，藥物的細(xì)胞毒作用的體外測定以及病原微生物的的快速檢測與鑒定,。 與臺盼蘭,、TTC、MTT,、MTS等分析法相比,，Alamar Blue具有更多的優(yōu)勢。Alamar Blue采用單一試劑,，可以連續(xù),、快速地檢測細(xì)胞的增生狀態(tài)。由于Alamar Blue對細(xì)胞無毒,、無害,，不影響細(xì)胞的抗體合成與分泌等活性，因此可以對同一批細(xì)胞的增生狀態(tài)進(jìn)行連續(xù)觀察和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察,，因此有操作簡便和幾乎不干擾細(xì)胞正常代謝的特點(diǎn),。 

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。產(chǎn)品4oC避光保存,，至少一年有效,。

注意事項(xiàng)

1） 需客戶自行準(zhǔn)備100%還原型Alamar Blue試劑。為得到還原型Alamar Blue,，需配制Alamar Blue與細(xì)胞培養(yǎng)基的混合溶液,，Alamar Blue與細(xì)胞培養(yǎng)基的比值為1:10，高壓滅菌15min,。（不能對濃縮的Alamar Blue高壓滅菌,，也不能用PBS配制溶液，因?yàn)?/span>100%還原型Alamar Blue在PBS中不穩(wěn)定,。）

2） 為得到的結(jié)果,，建議實(shí)驗(yàn)前先摸索孵育時間和接種細(xì)胞數(shù)量。

3） 合適密度的細(xì)胞可以增加檢測靈敏度,。對于96 孔板,，我們建議每孔接種100 微升細(xì)胞,，細(xì)胞濃度范圍為：貼壁細(xì)胞在100-10,000/孔，懸浮細(xì)胞在2,000-50,000/孔,，并以培養(yǎng)基為空白對照,。對于384 孔板，細(xì)胞濃度和接種量均減半,。

4） 整個過程均應(yīng)為無菌操作,，因?yàn)槲⑸镂廴疚锿瑯涌梢赃€原檢測試劑而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5） 注意接種細(xì)胞濃度和加入檢測試劑后孵育時間,。細(xì)胞濃度過高或孵育時間過長,，會導(dǎo)致繼發(fā)性還原反應(yīng)，產(chǎn)生無色和熒光消失,。

6） 孵育時,，須避光。

7） 本產(chǎn)品可以使用熒光或分光光度計檢測,，但熒光的靈敏度高,，實(shí)驗(yàn)誤差小，推薦使用熒光檢測,。

操作說明

一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測定*孵育時間和細(xì)胞數(shù)量）

1. 每孔加入100微升細(xì)胞懸液（對數(shù)生長期細(xì)胞）,，對細(xì)胞計數(shù),。按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個細(xì)胞濃度梯度,，每個濃度建議3-6個復(fù)孔,。注：設(shè)置陰性對照：細(xì)胞培養(yǎng)基中不加入細(xì)胞；陽性對照：100微升100%還原型Alamar Blue（不含細(xì)胞）,。

2. 每孔加入10微升Alamar Blue,。陽性對照孔中加入10微升無菌的超純水。

3. 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（37℃,5% CO₂）一定時間,。培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)開始變成粉紅色就可以進(jìn)入下一步,。

4. 推薦用熒光分光光度計檢測，激發(fā)光波長在530-560 nm之間,，發(fā)射光波長為590 nm,。

5. 普通分光光度計在570nm測定吸光度，參考波長600nm,。也可用570/630 nm和540/600 nm替代,。

6. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以細(xì)胞數(shù)量或孵育時間為橫坐標(biāo)（X軸）,，Alamar Blue還原率為縱坐標(biāo)（Y軸）,。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出適合的細(xì)胞數(shù)量或孵育時間（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要*）,。

二、細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖檢測

1. 每孔加入100微升細(xì)胞懸液（對數(shù)生長期細(xì)胞）,，對細(xì)胞計數(shù),。建議細(xì)胞數(shù)量為10⁴/ml，具體每孔需要的細(xì)胞數(shù)量,，需根據(jù)細(xì)胞類型決定,。

2. 細(xì)胞中加入待檢測藥物，為檢測藥物對細(xì)胞增殖的作用,，請設(shè)置合適的對照組,，包括刺激細(xì)胞和非刺激細(xì)胞。

3. 混勻,，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育（37℃,5% CO₂）一段時間,。

4. 每孔加入10微升Alamar Blue。陽性對照孔中加入10微升無菌的超純水,。

5. 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育（37℃,5% CO₂）4-8h,，*孵育時間取決于細(xì)胞類型。培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)開始變成粉紅色就可以進(jìn)入下一步,。

6. 推薦用熒光分光光度計檢測,，激發(fā)光波長在530-560 nm之間，發(fā)射光波長為590 nm,。

7. 普通分光光度計在570nm測定吸光度,，參考波長600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代,。

活力計算                                         

1. 普通分光光度計檢測

Alamar Blue還原率（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[(E570′×C600)-E600′×C570] ×100

E570=氧化型Alamar Blue在570nm波長的消光系數(shù)=80586,；

E600=氧化型Alamar Blue在600nm波長的消光系數(shù)=117216；

A570=檢測孔在570nm波長的吸亮度,；

A600=檢測孔在600nm波長的吸亮度,；

E570′=還原型Alamar Blue在570nm波長的消光系數(shù)=155677；

E600′=還原型Alamar Blue在600nm波長的消光系數(shù)=14652,；

C570=陰性對照孔在570nm波長的吸亮度（培養(yǎng)基,，Alamar Blue，無細(xì)胞）,；

C600=陰性對照孔在600nm波長的吸亮度（培養(yǎng)基,，Alamar Blue，無細(xì)胞）,；

如果使用570/630 nm和540/600 nm作為替代,，則：

E540=氧化型Alamar Blue在540nm波長的消光系數(shù)=47619；

E630=氧化型Alamar Blue在630nm波長的消光系數(shù)=34798,；

E540′=還原型Alamar Blue在540nm波長的消光系數(shù)=104395,；

E630′=還原型Alamar Blue在630nm波長的消光系數(shù)=5494,；

2. 熒光分光光度計檢測

Alamar Blue還原率（％）= （實(shí)驗(yàn)組F590-陰性對照組F590）/（100%還原型陽性對照F590-陰性對照組F590）×100

F590=590nm波長熒光值