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Coelenterazine 400a 腔腸素400a

產(chǎn)品信息

背景描述

腔腸素（Coelenterazine）是自然界中資源zui豐富的天然熒光素,，是絕大多數(shù)海洋發(fā)光生物（超過75%）的光能貯存分子,。腔腸素可作為許多熒光素酶的底物，比如海腎熒光素酶（Rluc）,，Gaussia分泌型熒光素酶（Gluc）,，以及包括水母發(fā)光蛋白（aequorin）和藪枝螅發(fā)光蛋白（Obelia）在內(nèi)的光蛋白（Photoproteins）。其發(fā)光原理是：以腔腸素為底物的熒光素酶在有分子氧的條件下,，氧化腔腸素,，產(chǎn)生高能量的中間產(chǎn)物，并在此過程中發(fā)射藍(lán)色光,，峰值發(fā)射波長(zhǎng)約為450~480nm,。

腔腸素作為水母發(fā)光蛋白復(fù)合物（Aequorin）的組成成分，只有與鈣離子（Ca²⁺）結(jié)合后,，才能被氧化生成高能量產(chǎn)物Coelenteramide,，同時(shí)釋放出CO₂和藍(lán)色熒光（~466nm）。其具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1）能檢測(cè)較大范圍的Ca²⁺濃度（0.1-100μM）,；2）樣品無(wú)自體熒光,，背景熒光較低，盡管信號(hào)較熒光鈣離子指示劑弱,，但信噪比更高,，因此具有較高靈敏度；3）Aequorin能夠穩(wěn)定維持在細(xì)胞內(nèi),，能夠進(jìn)行數(shù)小時(shí)至數(shù)天Ca²⁺的監(jiān)測(cè),。

圖1. 腔腸素作為水母發(fā)光蛋白輔助因子的Ca²⁺依賴反應(yīng)流程

腔腸素具有能量轉(zhuǎn)移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer,，BRET）的特性：在底物腔腸素存在的情況下，熒光素酶（如Rluc）催化底物發(fā)生藍(lán)光,，能量轉(zhuǎn)移到EYFP（增強(qiáng)的黃色熒光蛋白）,，發(fā)出綠光（~530nm）。通過Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白兩者間的相互關(guān)系研究蛋白-蛋白之間的相互作用,。BRET的信號(hào)可通過比較綠光和藍(lán)光的量來(lái)進(jìn)行測(cè)定,，消減了因細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞類型和其他實(shí)驗(yàn)變量而引起的數(shù)據(jù)變量,。

主要應(yīng)用

1. 活體成像,。

2. 報(bào)告基因檢測(cè)。

3. 檢測(cè)細(xì)胞/組織內(nèi)活性氧（ROS）水平：細(xì)胞和組織內(nèi)的超氧陰離子和過氧化亞硝基陰離子能夠增強(qiáng)腔腸素在酶非依賴性的氧化體系中自發(fā)熒光,。

4. 高通量篩選,。

5. 監(jiān)測(cè)活細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平。

產(chǎn)品描述

Coelenterazine 400a 腔腸素 400a系天然腔腸素衍生物,，是海腎熒光素酶（Rluc）的良好底物,，但不能被Gaussia分泌型熒光素酶（Gluc）氧化,。它的zui大發(fā)射波長(zhǎng)在400nm左右,，對(duì)GFP受體蛋白的信號(hào)干擾zui小，使得其成為BRET研究的*腔腸素類底物,。

產(chǎn)品性質(zhì)

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸,。粉末-20℃避光干燥保存,，保存在惰性氣體環(huán)境下,，避免接觸空氣,。

腔腸素400a工作液的配制

腔腸素400a溶解特性：不溶于水,。目前毒性zui低的溶劑是100%乙醇,，可配制濃度為0.1-1mg/ml,。加入pH低于7.0的酸性緩沖液（堿性pH會(huì)快速降解底物）稀釋成低濃度工作液,。切忌溶于DMSO,。

腔腸素400a保存特性：建議溶液現(xiàn)配現(xiàn)用,！體外實(shí)驗(yàn)，需將稀釋后的工作液室溫放置20-30min,，方可穩(wěn)定工作,。該工作液可室溫穩(wěn)定放置3-4h，有非常微弱的信號(hào)衰減發(fā)生,。不建議儲(chǔ)存液-20℃或更低溫度保存,，因?yàn)槠涓吣芰康亩醐h(huán)丁酮結(jié)構(gòu)即使在低溫的情況下也會(huì)發(fā)生降解，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度明顯變?nèi)?。短時(shí)間保存條件：-70℃避光保存于塑料管內(nèi)（溶液中不含有Ca²⁺）,，且有惰性氣體保護(hù),。

腔腸素工作液的配制：稱取1mg腔腸素400a粉末溶解于1ml乙醇（或甲醇）中配置成濃度為1mg/ml的母液。用商業(yè)化的Rluc反應(yīng)緩沖液稀釋到300µM（如127µl母液+1ml Rluc反應(yīng)緩沖液）,。然后取1.1ml 300µM溶液加入到6.6ml PBS中,，混勻。

BRET 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)發(fā)生變動(dòng)）

詳細(xì)步驟可參考文獻(xiàn)：Gersting SW, et al. Bioluminescence resonance energy transfer:an emerging tool for the detection of protein-protein interaction in living cells. Methods Mol Biol. 815:253-63 (2012),。

本步驟以Rluc的融合蛋白作為能量供體,，YFP的融合蛋白作為能量受體，兩者同時(shí)電轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞,，并通過加載腔腸素400a底物來(lái)啟動(dòng)氧化反應(yīng),，通過分析兩者BRET信號(hào)來(lái)研究?jī)蓚€(gè)蛋白之間的相互作用。

1. 按照正常流程將能表達(dá)兩個(gè)融合蛋白的質(zhì)粒,，按照3:1的比例（YFP : Rluc）共電轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞,。

2. 轉(zhuǎn)染后24h進(jìn)行BRET信號(hào)的檢測(cè)。吸去培養(yǎng)液（留約30μl）后,，將96孔板放到熒光酶標(biāo)儀上,。

3. 至少在測(cè)定前15min準(zhǔn)備腔腸素400a工作液。

4. 用超純水清洗注射泵后,，讓泵開始自動(dòng)吸取配制好的400a工作液,，按照每孔70µl工作液的量順序加入，使得每孔中底物的終濃度為30µM,。進(jìn)樣結(jié)束后,，孵育2min。之后立即進(jìn)行雙波長(zhǎng)熒光信號(hào)讀數(shù),，即Rluc信號(hào)（485nm）和BRET信號(hào)（535nm）,。

BRET信號(hào)值計(jì)算

為了能夠進(jìn)行數(shù)據(jù)評(píng)估，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Rluc信號(hào)（485nm）應(yīng)當(dāng)超過非轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞的（平均值+9×標(biāo)準(zhǔn)誤差）的區(qū)間,。

1. BRET–ratio（BRET信號(hào)比）基于以下等式進(jìn)行計(jì)算,，

R=（I_A/I_D）-cf

R代表BRET比值，I_D表示受體YFP熒光信號(hào)的強(qiáng)度（535nm）,，I_A表示供體Rluc熒光信號(hào)的強(qiáng)度（485nm）,，cf表示校準(zhǔn)因子（BRET_control/Rluc_{control D}），對(duì)照樣本是指共轉(zhuǎn)染YFP融合蛋白質(zhì)粒和不含供體第二個(gè)研究蛋白的Rluc載體的細(xì)胞熒光信號(hào),。

2. 陽(yáng)性對(duì)照,，使用YFP-Rluc融合蛋白的BRET比值為1.0。

3. 若蛋白之間有陽(yáng)性反應(yīng),，必須檢測(cè)到：8組蛋白樣本中至少有一組能夠產(chǎn)生超過設(shè)定閾值0.1以上的BRET信號(hào)比值,。

注意事項(xiàng)

1. 粉末使用惰性氣體（氮?dú)饣驓鍤猓?/span>密封良好的塑料管中避光保存于-20℃,，長(zhǎng)期保存于-70℃,。管內(nèi)即使存在少量空氣,，可能造成腔腸素cp氧化失活，造成在不同試驗(yàn)間的量化分析結(jié)果無(wú)法比較,。

2. 本品接觸空氣,，水或者任何氧化試劑會(huì)不穩(wěn)定。

3. 為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

附錄1.   腔腸素及其衍生物的特性

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