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Plant Preservative Mixture (PPM)

植物組培抗菌劑

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

植物組織培養(yǎng)可以依階段區(qū)分為：一,、引發(fā)愈傷組織( callus ),，因?yàn)橹挥?/span>callus可以進(jìn)行組織培養(yǎng)。 二,、從callus誘導(dǎo)成根或芽,。組培的方式可以分為3種：1）固體培養(yǎng)，將植物組織放置于固體培養(yǎng)基上,，通常培養(yǎng)在玻璃瓶或塑膠瓶?jī)?nèi),。2）平板培養(yǎng)，將植物組織埋于固體培養(yǎng)基中,，并且培養(yǎng)在培養(yǎng)皿,。3）液體培養(yǎng)，將植物組織培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，一般來(lái)說(shuō)培養(yǎng)在生物反應(yīng)器內(nèi),，可以再細(xì)分為靜止培養(yǎng),、懸浮培養(yǎng)和漂浮培養(yǎng)。在整個(gè)組織培養(yǎng)的過(guò)程,，zui擔(dān)心的就是微生物的污染,，所以用于植物組織培養(yǎng)的抗菌與抗真菌劑是非常必須的。

植物組培抗菌劑（Plant Preservative Mixture, PPM）是一種廣譜抗微生物劑,，可以殺死細(xì)菌和真菌細(xì)胞,，防止真菌孢子的萌發(fā)，并在較高濃度下能消除內(nèi)源性污染的外植體,。研究表明PPM活性成分可以穿透真菌或細(xì)菌細(xì)胞壁,，抑制檸檬酸循環(huán)和電子傳遞鏈等中心代謝循環(huán)中的關(guān)鍵酶的活性，并且可以抑制培養(yǎng)基中的單糖和氨基酸向真菌和細(xì)菌細(xì)胞的運(yùn)輸,。PPM能有效地抑制植物細(xì)胞和植物組織培養(yǎng)中的通過(guò)空氣,、水、人傳播的微生物污染及內(nèi)源性污染,，而不會(huì)影響體外種子發(fā)芽,、愈傷組織增殖和愈傷組織的再生。

產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)

與普通的抗生素相比,，優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：

1）是一種廣譜,、高效抗菌/抗真菌劑。

2）比常用抗生素價(jià)格更低廉,，可以作為植物組織培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)成分,，并可作為常規(guī)使用。

3）因?yàn)樗陌袠?biāo)是抑制多種酶,，所以產(chǎn)生抗耐藥性的突變體是不可能的,。

4）具有熱穩(wěn)定性，可以和培養(yǎng)基一起滅菌,。

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸,，4℃保存即可。

使用方法

以下所述的操作流程是通用的,，可能需要根據(jù)待處理的特定物種稍作改動(dòng),。

1含有PPM的培養(yǎng)基可以在超凈臺(tái)外面分裝，即無(wú)需無(wú)菌操作,，等瓊脂凝固后把蓋子蓋好,。如果用泵來(lái)分裝培養(yǎng)基，建議在分裝前后先用高壓滅菌處理的熱水清理導(dǎo)管/軟管,。

2如果儲(chǔ)存在無(wú)菌容器或在此之前儲(chǔ)備液未受污染,，含PPM的熱敏感或熱穩(wěn)定的液體培養(yǎng)基無(wú)需經(jīng)微孔濾膜或高壓滅菌處理,。但是對(duì)于含有200 mg/L或更多氨基酸或蛋白質(zhì)的富集培養(yǎng)基，建議加入PPM后用濾膜過(guò)濾處理,。

3超凈工作臺(tái)里的器具（鑷子或解剖刀）無(wú)需在火焰上燒,，只要定期地在70%酒精里蘸一下即可。超凈工作臺(tái)無(wú)需驗(yàn)證,，可以在超凈工作臺(tái)外面的干凈臺(tái)面上操作,，不超過(guò)一小時(shí)即可。

4 PPM溶液呈酸性,，pH 3.8,，需保存在4℃。低接種密度下推薦工作劑量0.05-0.2%（v/v）,，可在滅菌前或滅菌后加入培養(yǎng)基,，防止通過(guò)空氣傳播污染或內(nèi)源性污染。處理內(nèi)源性污染或獲得無(wú)農(nóng)桿菌的植物材料需要高劑量的PPM,。

5對(duì)于一些常規(guī)情況下表皮上被大量細(xì)菌或真菌孢子污染的種子來(lái)說(shuō)，PPM的抗菌效率可能比較弱,。對(duì)于體外萌發(fā)實(shí)驗(yàn),，

種子應(yīng)該按照傳統(tǒng)的方法先用漂白劑進(jìn)行表面消毒。因此,，在含有PPM的萌發(fā)培養(yǎng)基里,，在一個(gè)非滅菌的容器中種子可以在自來(lái)水下沖洗然后在超凈臺(tái)中吹干。如果所使用的器具末端接觸到活性細(xì)菌,、真菌組織或其它懷疑被污染的東西,，這些器具應(yīng)該通過(guò)高壓或電子加熱設(shè)備進(jìn)行滅菌。

6一般劑量水平：

除了內(nèi)源性污染以外,，推薦劑量是0.05-0.2%,。對(duì)于愈傷增殖、器官形成和胚胎形成,，推薦的劑量范圍是0.05-0.075%,。低接種密度或者處理緩慢生長(zhǎng)的細(xì)菌條件下，在培養(yǎng)基滅菌前或滅菌后加入此劑量的PPM,，可防止空氣傳播的污染和內(nèi)源性污染,。要消除更高密度的內(nèi)源性污染，需要增加PPM的劑量（參考7-內(nèi)源性污染）,。

7內(nèi)源性污染

a）對(duì)于外植體：以1cm（或更短）外植體為例,，添加4~5% PPM到*MS基礎(chǔ)鹽中，但千萬(wàn)不要添加Tween 20和 pH調(diào)整劑,，攪拌4~12小時(shí)之后直接拿出,。不用清洗，直接插入含有PPM的培養(yǎng)基里，若是草本植物換至0.05~0.1%PPM的萌發(fā)培養(yǎng)基即可,；而木本植物則換至0.2% PPM的萌發(fā)培養(yǎng)基,。

注意：以下從第7段（b）到10用于觀賞植物。

b）對(duì)于塊莖,，球莖和鱗狀物：把整個(gè)塊莖/球莖/鱗狀物在漂白劑里搖或攪拌,。然后用水沖洗（可以在非無(wú)菌條件下操作）。把塊莖/球莖切成小片,，在含有4-5%PPM的全基鹽中搖或攪拌12-24 h,，不要加pH調(diào)整劑和Tween 20。不用沖洗直接插入到含有0.1-0.2% PPM的培養(yǎng)基中,。

8如果按照以上操作流程沒(méi)有取得滿意的結(jié)果（尤其是厚的和非常密集的外植體,、種子），我們建議按照以下流程：

a）在水中搖或攪拌外植體（較軟的組織1h,，較堅(jiān)硬的組織2h）,；

b）在含有50% PPM的*MS基礎(chǔ)鹽中（不加pH調(diào)整劑和Tween 20）搖或攪拌5-10 min。

c）無(wú)需沖洗,，直接把處植體插入到培養(yǎng)基中,。如果真菌污染，可以選擇額外再加入PPM到培養(yǎng)基中,。

然而,，對(duì)于細(xì)菌或混合污染，*個(gè)月在培養(yǎng)基中加入0.05-0.2%的PPM是必要的,。不要丟棄高度氧化的

外植體,，因?yàn)榇蠹s50%的外植體在4-6周內(nèi)即可恢復(fù)正常。

9為了消除“組培中”污染的植物材料（搶救措施）：

注意：僅適合明顯觀察到受污染不超過(guò)一周的組織,。

a）在自來(lái)水細(xì)水流下面用牙刷清洗材料,。在含有50% PPM（用滅菌水稀釋）中搖或攪拌5-15 min。對(duì)于細(xì)菌或混合污染,，我們建議用低pH值2.8-3.2的溶液,，即100% PPM與0.6g/L的檸檬酸溶液（用滅菌水）按1：1混合。

b）不用沖洗直接把處理好的材料插入到含有0.05-0.2% PPM的培養(yǎng)基里,，培養(yǎng)至少一個(gè)月,。前10天弱光培養(yǎng)，如上所提,，不要丟棄高度氧化的外植體,，等4-6周以后將約有50%的材料恢復(fù)。

對(duì)于真菌孢子或細(xì)菌位于外植體極深的部位,，而PPM無(wú)法接觸到的情況,，需要把材料在水中浸泡一段時(shí)間,，然后沿著外植體切片，在50% PPM中搖或攪拌5-15 min,。通過(guò)以上消毒步驟,，保證PPM能夠充分接觸到外植體的整個(gè)表面。

10去除農(nóng)桿菌：

共培養(yǎng)之后,，用水沖洗葉盤,。然后把轉(zhuǎn)染的葉盤在含有100% PPM的*基礎(chǔ)鹽中蘸（整個(gè)葉盤）約2 min。 用兩張無(wú)菌紙巾吸干放到含有常用抗生素的培養(yǎng)基上,。三周后,，轉(zhuǎn)到只含有0.05-0.075% PPM的培養(yǎng)基上。

注意事項(xiàng)

1）采用PPM消毒后*轉(zhuǎn)移的材料,，我們建議把外植體*地插入半固體培養(yǎng)基中,。

2）50% PPM溶液能重復(fù)利用大約5-10次。重復(fù)利用的次數(shù)取決于所處理外植體的體積和接種密度,。保存50% PPM在4℃以延長(zhǎng)它的活性,。如有必要，準(zhǔn)備兩種PPM消毒液：一種是滅菌內(nèi)源性污染,，第二種是滅菌“組培中”的污染,。用第二種消毒溶液處理材料后都要用0.2 μm的濾膜濾滅，濾滅過(guò)程可以非無(wú)菌條件下完成,。一個(gè)濾器能用于溶液濾滅的整個(gè)過(guò)程。

3）如果用50% PPM處理材料效果仍不佳,，可以用100% PPM,。處理方法跟50% PPM相似，但處理時(shí)間不要超過(guò)10 min,。

4）PPM 的使用為任何一個(gè)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)便利,，并極大地提高技術(shù)人員和實(shí)驗(yàn)室的工作效率。但每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的工作條件不同可能使得PPM效力的發(fā)揮具有一定的波動(dòng)性,。建議工作人員根據(jù)以上步驟操作的前提下,，并進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整以確認(rèn)PPM效力發(fā)揮的*工作條件，或者確認(rèn)PPM是否能滿足其特定的應(yīng)用要求,。整體來(lái)說(shuō),，PPM是能夠非常有效的預(yù)防植物樣本受到的空氣污染，水介質(zhì)污染以及人源接觸帶來(lái)的各種污染,。使用得當(dāng),，PPM可以拯救內(nèi)源性污染的外植體；推薦劑量（0.05-0.2%（v/v））下PPM幾乎不造成任何負(fù)面損傷,。

5）為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

僅作科研用途