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Lymphocyte Separation Medium 1.084

淋巴細胞分離液 1.084

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

淋巴細胞分離液（Lymphocyte Separation Medium 1.084，簡稱LSM-1.084）是一種無菌的即用型分離液,，基于Böyum的Ficoll-甲泛影鈉溶液做過一些改良,，使得操作簡單快速且分離效率更高。本品是無菌的聚蔗糖Ficoll/泛影酸鈉混合溶液,，密度為1.084 g/ml,，內(nèi)毒素含量很低（＜0.12 EU/ml），是在嚴格控制的環(huán)境下加工生產(chǎn)的,，生產(chǎn)條件符合ISO13485:2003標準和GMP認證。相對于密度為1.077 g/ml的人淋巴細胞分離液,，本品適用于分離更高密度的人單個核細胞,，包括外周血,，臍帶血以及骨髓瘤來源的組織樣本。還適用于分離大小鼠血細胞,，正因為嚙齒動物的淋巴細胞密度稍高于人淋巴細胞,。

工作原理

去纖維蛋白或抗凝人血以1：1的比例用無菌生理鹽水或平衡鹽溶液稀釋，小心的添加在分離液上層（不要混雜在一起）,，之后離心30-40min,。離心過程中，差速遷移使其zui終形成幾個不同的細胞分層：

①  聚集在管底的顆粒主要是Ficoll 聚集的紅細胞以及沉淀物,；

②  緊挨著上面一層的顆粒主要是粒細胞,，其處于LSM-1.084溶液的滲透壓臨界，具有足夠高的密度遷移穿過LSM-1.084溶液層,。

③  單個核細胞分布在血漿和LSM-1.084分離液的中間層,，還包括一些沉降系數(shù)低（密度低）的顆粒，如血小板,。

淋巴細胞,，單核細胞和血小板不具有足夠高的密度穿透LSM-1.084分離液層，因此這些細胞在血漿和LSM-1.084分離液層聚集形成一個中間分層,。吸取中間層,，用平衡鹽溶液短暫洗滌，以除去血小板,，細胞分離介質(zhì)和血漿,，就可以單個核細胞。通常情況下,，分離所得的細胞中95±5%為單個核細胞,，細胞存活率＞90%，回收率為60±20%,。

運輸與保存方法

室溫運輸,。

4-30 °C密閉避光環(huán)境下可穩(wěn)定保存3年。開瓶后需4-8 °C保存,。

影響單個核細胞分離效果的因素

1. 血液樣品保存時間

血液盡可能新鮮且無血塊,。血液放置過久可能會降低細胞存活率、回收率,，甚至有可能引入粒細胞和/或紅細胞污染,。

1. 血液體積

血液量和管徑?jīng)Q定樣本在管子中的高度，以及后續(xù)的離心時間,。提高離心管內(nèi)的血液高度會引入紅細胞污染的可能,。但是分離效率不會明顯受管徑的影響。因此,，對于體積大的血樣,，建議可在保持離心時間不變的情況下選擇更大直徑的離心管,。

1. 紅細胞去除效率

單個核細胞分離的產(chǎn)量和純度與紅細胞是否去除干凈有關(guān)。

若全血中紅細胞發(fā)生凝集會導致一些單個核細胞也被聚集在內(nèi),，從而在離心后被沉降在紅細胞層內(nèi),。可通過稀釋全血的方法來避免此現(xiàn)象,。溫度大小會影響紅細胞的凝集,，18℃條件能提供*的分離效果。若溫度升高（如37℃）會提高紅細胞凝集的可能,，降低分離效果,。低溫（4℃）環(huán)境紅細胞聚集可能降低，需要增加離心時間,。提高離心時間到5-10min能減低紅細胞污染,。

1. 血小板污染

對于血小板要求較為嚴格的分離實驗，使用4-20%的蔗糖梯度層加在LSM-1.084溶液層上方,，再次離心以去除所有的血小板,。離心后，血小板分布在蔗糖溶液上方,，單個核細胞穿過蔗糖溶液停留在LSM-1.084溶液上方,。

操作方法

1. 材料準備

• 樣本體積（4ml總體積）：取2ml的去纖維蛋白或抗凝血，將其與等體積（2ml）的無菌鹽溶液以1：1比例混合,。注：大體積的血樣可以得到相同的分離效率,，只需要選用更大直徑的離心管，以維持血樣的高度（約3cm）和LSM-1.084溶液的高度（約2.4cm）,。
• LSM-1.084分離液,，使用前需放到室溫環(huán)境下溫度平衡10-30min；
• 平衡鹽溶液：用做稀釋和清洗液,，建議直接購買商業(yè)化的鹽溶液,。也可以使用其他溶液，如不含Ca²⁺/Mg²⁺的磷酸鹽溶液（如DPBS溶液）,，Hank’s,，或者細胞培養(yǎng)液（如RPMI 1640）。

1. 分離單個核細胞

1. 取2ml的去纖維蛋白或抗凝血,，將其與等體積（2ml）的無菌鹽溶液以1：1比例混合,，于10-15ml離心管中顛倒混勻，或用槍上下輕輕吹打數(shù)次以至混勻,。

注：肝素,、EDTA、檸檬酸鈉、ACD,、CPD抗凝皆可,。去纖維蛋白血不需要抗凝劑。

1. 使用前輕輕顛倒瓶子使LSM-1.084充分混合,，用注射器或槍頭無菌條件轉(zhuǎn)移3 ml LSM到10-15 ml離心管中。
2. 小心將稀釋血液加入3 ml LSM-1.084（室溫即可）的上層,，使得在血液和LSM間形成一個明顯的分層,。不要將稀釋血液混入LSM-1.084中，如圖1,；

圖1 加樣后分層示意圖

4）室溫下400×g離心30-40min,，離心可以沉淀紅細胞和多形核白細胞，同時可以在LSM-1.084上形成一層單核-淋巴細胞分層,，如圖2所示（從上到下,，依次分為血漿層-單個核細胞層-LSM-1.084層-粒細胞-紅細胞）；

5）用無菌槍頭吸掉單個核細胞層（含淋巴細胞和單核細胞）上方2-3mm的血小板/血漿,，小心操作勿吸入單個核細胞層內(nèi)破壞其平衡（如圖2）,。

注：也可以不用先吸走血漿層，直接用槍吸取單個核細胞層,。另外,，上層血漿不含細胞，也可以留作他用,。

圖 2  吸除上層血漿和血小板前后分層示意圖

6）用無菌槍頭將單核細胞層轉(zhuǎn)移入一個新的無菌離心管。

注：一定要吸取所有的單個核細胞中間層,，以及少量上方的血漿液和下方的LSM-1.084分離液,。

7）預估轉(zhuǎn)移后的單個核細胞量，加入至少3倍體積（約6ml）的平衡鹽溶液于上述離心管中,。

8）使用槍頭上下輕輕吹打?qū)螌蛹毎芤撼浞謶腋　?/span>

9）室溫400-500×g離心10-15min,。

注：高速離心有助于提高單個核細胞的回收率，但如果需要*去除血小板,，則推薦低速離心（60-100×g）,。

10）去除上清，加入6-8ml平衡鹽溶液重懸單核細胞,。

11）室溫400-500×g（或者60-100×g去除血小板）離心10min,。

12）去除上清，用適當培養(yǎng)基重懸單個核細胞備用,。

3. 分離粒細胞

1）-6）同上方單個核細胞的分離步驟,。

7）小心吸除LSM-1.084層，注意切勿吸入粒細胞層,。

8）轉(zhuǎn)移暴露在表面的白色粒細胞層（位于紅細胞層上方）于一個無菌的50ml離心管,。

9）加入至少5倍體積的平衡鹽溶液重懸粒細胞,，于400×g離心15min。

10）吸除上清,，加入6-8ml平衡鹽緩溶液重懸粒細胞,，于室溫400-500×g離心10min。

11）吸除上清,，用適當培養(yǎng)液重懸粒細胞備用,。

注意事項

1. 稀釋去纖維蛋白血液或肝素化血液用的鹽溶液為無菌液體；
2. 為保持淋巴細胞的活性,，應該采血后盡快進行分離,。分離細胞層實際上是單個核細胞層，包括淋巴細胞和單核細胞,。
3. 為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作；