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產(chǎn)品描述

5-BrdU 溴化去氧尿苷目前常用的細(xì)胞增殖標(biāo)記物有4種，DNA聚合酶α（DNA polymerase α）,，增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）,，Ki-67和5-溴脫氧尿嘧|啶核苷（Brdu）,。其中Brdu為組織細(xì)胞非內(nèi)源性表達(dá)存在，應(yīng)用相對較廣,。Brdu,，也稱為溴化去氧尿苷，一種合成的胸苷類似物,，在S期可替代胸腺嘧啶核苷選擇性結(jié)合到細(xì)胞DNA中,。從而檢測細(xì)胞DNA合成和標(biāo)記細(xì)胞分裂，凋亡等行為,。在遺傳研究中Brdu可通過活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)加載,，然后使用抗Brdu的單克隆抗體進行特異性標(biāo)記，ICC或IHC法染色法顯示增殖細(xì)胞,。另外,，還能同時結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色,，來判斷增殖細(xì)胞的種類,，增殖速度等，對研究細(xì)胞動力學(xué)有著重要意義,。

產(chǎn)品性質(zhì)

運輸和保存方法

冰袋運輸。-20℃干燥保存,，2年有效,。

操作步驟

1.Brdu儲存液的準(zhǔn)備
用1X DPBS充分溶解適量的Brdu配置10 mg/mL的母液，過濾除菌后,，按照0.5mL/管的量分裝放在-20°C或者-80°C長期保存，避免反復(fù)凍融。Brdu儲存液再融化后,，4°C可穩(wěn)定存放一周,。
2.體內(nèi)Brdu標(biāo)記

1）腹腔注射法（常用）：無菌的10 mg/mL（溶于DPBS）適合用于體內(nèi)注射用。按照100-200 μL（1-2 mg） Brdu的量腹腔注射到小鼠體內(nèi),。注意：最短在注射后0.5 h后在小腸,，胸腺和骨髓瘤處就能檢測到Brdu。而一般在注射后24 h內(nèi)幾乎所有組織都能檢測到Brdu,。這個時間可能對于一些快速分化的組織如小腸來說有些久,。

2）根據(jù)自身的實驗體系，在合適的時間點處死動物,，摘除待研究的組織,。使用冰凍切片或者石蠟包埋的方法進行組織處理和切片制備。然后進入后續(xù)的IHC染色步驟,。

3.體外Brdu標(biāo)記（培養(yǎng)原代細(xì)胞或者細(xì)胞系）

注：總的來說,，10 μM Brdu（稀釋于培養(yǎng)液）是一個比較合適的方法用來標(biāo)記不同物種來源的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。當(dāng)然,，建議針對具體的實驗體系優(yōu)化方法,。

1）在96孔板上按標(biāo)準(zhǔn)步驟進行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)時間一般為1-72 h,；

2）Brdu工作液的準(zhǔn)備：用組織細(xì)胞培養(yǎng)液按照1:30的比例稀釋儲存液得到1mM Brdu工作液,。然后取10 μL 1 mM Brdu溶液直接加入1 mL組織培養(yǎng)液即得到最終工作液。37°C溫?zé)帷?/span>

3）按100 μL/孔Brdu工作液的量進行細(xì)胞標(biāo)記,，37°C孵育60 min~過夜,。同時設(shè)置非Brdu標(biāo)記的細(xì)胞作為陰性對照。注意：最佳的孵育時間取決于細(xì)胞增殖速度以及需要達(dá)到的實驗?zāi)康?。比如,，對于快速增殖?xì)胞（如HL-60）有效孵育時間為30-45 min；對于原代細(xì)胞（如未受外源刺激培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞）孵育時間可能需要24 h,。細(xì)胞密度最好不要超過2x106 cells/mL,。

4）制備單細(xì)胞層玻片，使用以下任何一種方法：

a.細(xì)胞離心涂片（cytospin）制備：使用細(xì)胞離|心涂片機,，將100 μL標(biāo)記好的細(xì)胞（濃度為：1-2 x106 cells/mL）直接離心到干凈,，無脂肪，poly-L-lysin包被的玻片上,，風(fēng)干,。

b.細(xì)胞涂片（cell-smear）制備：取一小滴標(biāo)記好的細(xì)胞懸液于干凈，無脂肪,，poly-L-lysin包被玻片的一端,，然后用第二個干凈玻片將其均勻涂布成一薄層。室溫風(fēng)干。

5）將玻片置于70%冰乙醇放在-20°C下固定20-30 min,。

6）PBS清洗細(xì)胞3次,，每次5 min。

7）加入1.5M HCl中室溫孵育30 min,。注意：DNA的變性對于Brdu染色的成功至關(guān)重要,。

8）吸去HCl，PBS清洗2次,，每次5 min,。

9）進入后續(xù)ICC染色步驟。

4. 體外Brdu標(biāo)記（組織薄片）

1）Brdu工作液的準(zhǔn)備：用組織細(xì)胞培養(yǎng)液按照1:30的比例稀釋儲存液得到1 mM Brdu工作液,。然后取10 -20 μL 1 mM Brdu溶液直接加入1 mL組織培養(yǎng)液即得到最終工作液,。確保有足夠的工作液（37°C溫?zé)幔?span style="color: rgb(60, 80, 108); font-family: 思源雅黑, SimSun; background-color: rgb(255, 255, 255);">全部浸泡組織。

2）用手|術(shù)刀或者鋒利的刀片將組織切割成約1 mm厚,，2 mm2大小的薄片,。建議在溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基內(nèi)進行切片，利于維持組織的活力,。

3）轉(zhuǎn)移組織薄片至預(yù)裝有10 mL Brdu標(biāo)記液的15 mL離心管內(nèi),。于37°，CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育需要的時間,。孵育時間可變,，取決于組織薄片類型以及需要達(dá)到的實驗?zāi)康模ǔＳ玫臑?-4 h）。直接丟棄未用完的標(biāo)記液,。

4）37°C PBS清洗組織薄片,，每次5 min。

5）使用標(biāo)準(zhǔn)的冰凍切片或者石蠟包埋切片的方法固定組織,。

HB210525