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Western Blot快速實驗攻略

一,、Western Blot實驗原理

蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）是將蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上,，然后利用抗體進行檢測的技術(shù)。完整的WB流程，如下圖所示,，包含樣本制備,、SDS-PAGE,、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合,、蛋白檢測等5個大步驟,。

二,、試劑準(zhǔn)備

1. 各類緩沖液

1）電泳緩沖液：10xTris-Glycine-SDS電泳緩沖液（20319ES76）

2）電轉(zhuǎn)緩沖液：Western Blot電泳電轉(zhuǎn)通用緩沖液（20329ES03）

3）蛋白上樣緩沖液：5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（20315ES05）

4）其他緩沖液：PBS，TBST

2. 樣本制備

1）細(xì)胞裂解液：RIPA（20101ES60,，或20115ES60，或20114ES60）

2）蛋白酶抑制劑：PMSF（20104ES03）

3. 蛋白定量

1）蛋白定量試劑：BCA蛋白定量試劑盒（20201ES76）

4. 蛋白電泳

1）預(yù)制膠：4-20%梯度預(yù)制膠,，12孔（36214ES10）

2）蛋白marker：三色預(yù)染蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)（10-245kDa）（20352ES76）

5. 轉(zhuǎn)膜與封閉

1）膜（自備）

2）膜上蛋白檢測：麗春紅染色液（36221ES60）

3）膜的封閉：BSA，無IgG（36103ES25）

6. 抗體孵育

1）抗體：內(nèi)參抗體,、一抗,、二抗（例：30101ES10，30401ES10,，34101ES60）

2）檢測試劑：ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒（36208ES60）

三、實驗步驟

1. 樣本制備

1）融解RIPA裂解液,，混勻,。取適當(dāng)量的裂解液,，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM,。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液,，用PBS,、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液,。用槍吹打數(shù)下,，使裂解液和細(xì)胞充分接觸,。細(xì)胞充分裂解后應(yīng)無沒有明顯的細(xì)胞沉淀,。

懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散,。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞,。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀,。如果細(xì)胞量較多,，必需分裝成0.5-1×10⁶個細(xì)胞/管，然后再裂解,。

組織樣本：按照每20 mg組織加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液,。用玻璃勻漿器勻漿,，直至充分裂解。

3）充分裂解后,，10000-14000g離心3-5min，取上清,，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作,。

【注】：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物,，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等復(fù)合物,。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗,；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物,，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗,。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB,、p53等時，通常不必進行超聲處理,，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子,。

2. 蛋白定量

1）配制BSA標(biāo)準(zhǔn)品體系

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為蛋白樣品的溶解液,，原則上蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋,。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS進行稀釋,。BSA標(biāo)準(zhǔn)品體系配制可參考下表,。

表1 BSA標(biāo)準(zhǔn)品體系配制（微孔板檢測，線性范圍20-2000μg/mL）*

*如用比色皿檢測，每管需加100μL標(biāo)準(zhǔn)品,，按3個重復(fù)計算，每個濃度至少需配制300μL,。

2）各取25μL標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品加入到微孔板中,。

3）每孔加入200μL BCA工作液，振蕩30s充分混勻,。蓋上微孔板，37℃孵育30min,。

4）冷卻到室溫,，在酶標(biāo)儀上的540-595nm波長范圍處檢測吸光度，其中562nm波長為*,。

5）根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度（減去標(biāo)準(zhǔn)品中空白孔的OD值即zui終的讀數(shù)），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（X-蛋白濃度ug/mL,；Y-zui終的OD562nm）,。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的稀釋倍數(shù)計算樣品蛋白濃度,。

3. 蛋白電泳

1）剪開包裝取出預(yù)制膠,，撕去膠板底端橙色膠紙，將預(yù)制膠固定在電泳槽中,，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液,，外槽液面低于內(nèi)槽5-10mm，雙手按住梳子左右部位將其平穩(wěn)緩慢（一定要慢,，否則會將膠齒拔斷或拔歪）拔出。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5×SDS-PAGE上樣緩沖液,。水浴溶解后立即室溫存放,。

3）按照每4 μL蛋白樣品加入1μl 5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液的比例,，混合蛋白樣品和5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱 3-5min，以充分變性蛋白,，之后冷卻至室溫備用,。

5）在每個樣品孔中上樣20-40µg蛋白,，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋,，打開電源,，推薦使用低壓100V,，跑15min，之后換高壓150V跑,，通常電泳至藍(lán)色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳,。

6）電泳后取出膠板,，用鑷子或小螺絲刀沿左右兩板間的縫隙將兩板別開，掰開兩板,，將膠取出,，棄去塑料板，此時蛋白會從凝膠上慢慢擴散,，因此不要保存在凝膠里，要迅速進行下一步的轉(zhuǎn)移操作,。

4. 轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min,。（如果檢測小分子蛋白質(zhì)，可省略該步驟,，因小分子蛋白容易擴散）。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片,，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜,，需參照說明書,，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中,。（膜的選擇：0.45μm孔徑，用于一般蛋白,；0.2μm孔徑,，用于分子量小于20kD蛋白；0.1μm孔徑,，用于分子量小于7kD蛋白。）

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿,，每層放好后,，用試管趕盡氣泡,。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治,，膜靠近陽極,，膠靠近陰極,，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極,，100V,，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,，切斷電源,，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中,，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶,。注：如果沒有出現(xiàn)染色條帶，則表示轉(zhuǎn)膜失敗,，可能需要重新轉(zhuǎn)膜或重新上樣電泳,。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水,，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次,，每次5min,。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min,；倒去洗脫液，再重復(fù)一次,。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min,。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中,，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次,，每次15min,。

5. 抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4°C下孵育過夜并不時輕輕晃動,。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗,。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動,。

4）用5mL TBST洗滌三次,，每次15min,。

5）zui后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書,，新鮮配制發(fā)光工作液,。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液,，勿使膜*干燥,。將膜*浸入發(fā)光工作液（125μL發(fā)光工作液/cm²膜）中,，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min,，準(zhǔn)備立即壓片曝光,。

7）用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液,。但勿洗去發(fā)光液。

8）在X光膠片暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜,。將印跡膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來*包裹印跡膜,，去除氣泡和皺褶,，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液,。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白帶面向上,。

9）暗房內(nèi)壓X光膠片,，分別曝光不同的時間,，如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗,。（從剛開始的10s曝光時間中可以看出適當(dāng)?shù)钠毓鈺r間,。由于檢測反應(yīng)的動力學(xué)特征，在孵育后信號立即變得zui強,，但在隨后的2小時內(nèi)會減弱。）

三,、常見問題