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一氣呵成,，Hieff Clone攻無不“克”

------克隆新思路，給你好看

Yeasen Hieff CloneTM 一步法克隆試劑盒榮登SCI*期刊:《Cell》《Science》.

詳情點擊：http://www.yeasen。,。ｃｏｍ/CompanyNews/1930.htm

          http://www.yeasen。,。ｃｏｍ/CompanyNews/1951.htm

基于限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的經(jīng)典分子克隆技術(shù),，易出現(xiàn)假陽性，克隆效率不高,。此外,，該技術(shù)受到多種實驗因素的限制，包括酶切位點的選擇、插入片段制備繁瑣,、T4 DNA連接酶序列的偏好性,、連接反應(yīng)時間長等。

提高克隆效率的關(guān)鍵,，增加配對堿基數(shù)

圖1. 幾種克隆方法連接效率的比較

翊圣生物經(jīng)數(shù)年潛心研究,，精益求精。摸索與優(yōu)化反復(fù)循環(huán),，實現(xiàn)了“末端同源重組技術(shù)”由理論到應(yīng)用的升級,，研發(fā)出Hieff Clone^TM系列克隆產(chǎn)品。該系列產(chǎn)品克隆效率顯著提升,，可達(dá)95%以上,。基于同源重組的方式,，該系列產(chǎn)品無需考慮酶切位點,，適用于任何載體和任意片段的連接。同時兼具連接反應(yīng)時間短（20 min）,、操作簡單等優(yōu)勢,。

非凡匠心，帶來*品質(zhì)

翊圣生物在成熟的工具酶表達(dá)純化平臺基礎(chǔ)上,，獲得高純度重組酶,，并反復(fù)優(yōu)化重組酶反應(yīng)微環(huán)境，保證Hieff Clone^TM克隆試劑盒的*品質(zhì),。它可以將任意線性化載體和具有與其兩端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆,。Hieff Clone^TM克隆試劑盒簡便、快速,、,，是無縫克隆的。

● 無需考慮酶切位點：不受插入片段酶切位點的限制,，適用于任何載體,；插入片段兼容粘性或平末端,。

● 設(shè)計簡單：在插入片段的PCR擴(kuò)增引物5’端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可,。

● 快速：50℃，20 min即可完成重組反應(yīng),?？寺￡栃月士蛇_(dá)95%以上。

● 應(yīng)用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆,，也可結(jié)合Canace高保真酶,，應(yīng)用于定點突變。

方法對比

Hieff Clone^TM一步法快速定向克隆試劑盒分為單片段克隆和多片段克隆試劑盒，實驗流程見下圖,。

圖2：Hieff Clone^TM一步法快速定向克隆試劑盒進(jìn)行單片段和多片段克隆實驗流程圖,。

①線性化載體的制備：酶切或PCR制備線性化載體。②插入片段的制備：在目的DNA片段上下游引物的5’端引入20 bp左右載體末端同源序列,；PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段,。③重組反應(yīng)：按比例混合線性化載體和目的DNA片段進(jìn)行重組，50℃反應(yīng)20 min,。④轉(zhuǎn)化,、涂板：將重組產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化后涂平板。挑取克隆,。

★ 單片段重組

圖3：Hieff Clone^TM One Step Cloning Kit可以有效克隆不同長度的單片段基因,。

A-D：重組轉(zhuǎn)化平板。E：插入片段和載體濃度檢測電泳圖,。F-H：插入片段PCR鑒定電泳圖,。箭頭指示目的條帶。載體：pFastBac1,，4.7 kb,，插入片段大小分別是1.2 kb，3 kb和5 kb,，載體與插入片段摩爾比：1:3,，重組反應(yīng)條件：50℃，20 min,。

★ 多片段輕松重組

圖4：Hieff Clone^TM Plus Multi One Step Cloning Kit進(jìn)行三片段克隆,。

A：重組轉(zhuǎn)化平板。B：插入片段和載體濃度檢測電泳圖,。C：PCR方法鑒定每個單片段和zui終連接基因,。箭頭指示目的條帶。載體：pCAMIBA1302,，10 kb,，三個插入片段長度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb,，重組反應(yīng)條件：50℃,，20 min。

★ 載體與插入片段摩爾比1:3左右zui適

圖5：Hieff CloneTM One Step Cloning Kit進(jìn)行單片段和載體不同摩爾濃度比例重組克隆測試,。

A-C：重組轉(zhuǎn)化平板,。載體與插入片段的分子摩爾數(shù)比分別是1:2（A），1:3（B）和1:4（C）,，重組反應(yīng)條件：50℃,，20 min,。

★ 重組反應(yīng)時間20-30 min*

圖6：Hieff CloneTM One Step Cloning Kit進(jìn)行不同重組反應(yīng)時間克隆測試。

A-C：重組轉(zhuǎn)化平板,。重組反應(yīng)時間分別是20 min（A）,，25 min（B）和30 min（C），重組反應(yīng)溫度：50℃,。

• 率重組

實驗信息：載體大?。?/span>10217 bp；目的片段大?。?352 bp,。

圖7：使用Hieff Clone^TM Plus One Step Cloning Kit進(jìn)行克隆，克隆陽性率100%,。

A：陰性對照轉(zhuǎn)化平板,。B：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板。C：1和2分別為原始載體和線性化載體濃度檢測電泳圖,。D：目的片段的濃度檢測電泳圖,。E：目的片段的菌落PCR鑒定電泳圖。F：1為重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖,，2為原始質(zhì)粒酶切對照圖,。M：DL10000. (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)) 

• 長片段重組

實驗信息：載體大小：8000 bp,，目的片段大?。?500 bp。

實驗數(shù)據(jù)：

圖8：使用Hieff Clone^TM Plus One Step Cloning Kit進(jìn)行克隆,。

A：陰性對照轉(zhuǎn)化平板,。B：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板。C：載體和目的片段的濃度檢測電泳圖,。D：菌落PCR鑒定電泳圖,，箭頭指示目的條帶。 M₁：Marker Ⅲ,；M₂：100 bp DNA ladder,。(仁濟(jì)醫(yī)院)

• 短片段重組

實驗信息：載體大小：5500 bp,；目的片段大?。?9 bp。

實驗數(shù)據(jù)：

圖9：使用Hieff Clone^TM Plus One Step Cloning Kit進(jìn)行克隆,。

A：陰性對照轉(zhuǎn)化平板,。B：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板。C：載體濃度檢測電泳圖,。D：克隆測序?qū)Ρ葓D，為陽性結(jié)果。M：Trans 2K plus II DNA ladder.(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院)

• 多片段重組

實驗信息：載體大?。?996 bp,；四個片段大小：576 bp,，867 bp,，915 bp和647 bp。

實驗數(shù)據(jù)：

圖10：使用Hieff Clone^TM Multi One Step Cloning Kit進(jìn)行克隆,。

A：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板,。B：1為載體酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖。C：菌落PCR驗證結(jié)果,，其中1為原始質(zhì)粒對照電泳,，2-5為重組質(zhì)粒，僅檢測863bp的一個目的片段,，6為假陽性,。D：陽性克隆測序結(jié)果。M：Marker II,。（微生物所)

◆ 低濃度載體重組

實驗信息：載體大?。?/span> 4700 bp，目的片段大?。?600 bp,。

實驗數(shù)據(jù)：

圖11：使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit進(jìn)行克隆。

A：重組轉(zhuǎn)化平板,。B：載體濃度檢測電泳圖,。C：插入片段濃度檢測電泳圖。D：克隆基因PCR鑒定電泳圖,。箭頭指示目的條帶,。載體濃度：5 ng/μL，插入片段濃度：25 ng/μL,，載體與插入片段摩爾比例為1:2,，重組反應(yīng)條件:50℃，20 min,。(西南大學(xué))

圖12：Hieff Clone^TM Plus Multi One Step Cloning Kit與不同品牌的同類產(chǎn)品相比,，顯示出更高的性價比

已得到廣大用戶認(rèn)可——使用客戶數(shù)量600+

主要有：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，北京大學(xué),，中國農(nóng)業(yè)大學(xué),，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，華東理工大學(xué),，上海交通大學(xué),，復(fù)旦大學(xué),，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，浙江大學(xué),，中國藥科大學(xué),，武漢大學(xué)，中山大學(xué),，東南大學(xué),，南京林業(yè)大學(xué)，華南農(nóng)業(yè)大學(xué),，南京農(nóng)業(yè)大學(xué),，南方醫(yī)科大學(xué)，山西師范大學(xué),，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院中國水稻研究所,，中國科學(xué)院水生生物研究所，暨南大學(xué),，中科院健康科學(xué)研究所,，中國科學(xué)院動物研究所，華東師范大學(xué),，同濟(jì)大學(xué),，中國科學(xué)院微生物研究所，第二軍醫(yī)大學(xué),，上海市東方醫(yī)院,，上海植物逆境生物學(xué)研究中心，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所,，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，中國科學(xué)院植物研究所,，中國科學(xué)院南京土壤研究所,，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所,，中國科學(xué)院生物物理研究所,，中國科學(xué)院南海海洋研究所，中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所,，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院等單位的課題組,。

Q：Hieff Clone^TM克隆的原理是什么？

A：利用末端同源重組的原理,。將任意線性化載體和具有與其兩端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆,。

Q：與傳統(tǒng)克隆相比，Hieff Clone^TM克隆有什么優(yōu)勢,？

A：1）無需考慮酶切位點：不受插入片段酶切位點的限制,，適用于任何載體,；插入片段兼容粘性或平末端。

2）設(shè)計簡單：在插入片段的PCR擴(kuò)增引物5’端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可,。

3）快速：50℃,，20 min即可完成重組反應(yīng),?？寺￡栃月士蛇_(dá)95%以上。

4）應(yīng)用廣泛：可用于單片段或多片段定向克隆,，也可結(jié)合Canace高保真酶,，應(yīng)用于定點突變。

Q：同源序列長度對重組效率的影響,？

A：同源序列的長度與克隆數(shù)目有相關(guān)性,，一般同源片段選擇在20 bp左右，可以在15 bp-25 bp范圍內(nèi)調(diào)整,。并且選擇盡量避免出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),。

Q：線性化載體和目的片段產(chǎn)物的質(zhì)量會影響重組反應(yīng)嗎？

A：線性化載體或目的片段品質(zhì)較差時會極大影響重組反應(yīng),，建議割膠回收純化產(chǎn)物,。

Q：一步法快速定向克隆試劑盒對感受態(tài)細(xì)胞有要求嗎？

A：推薦使用轉(zhuǎn)化效率為10⁸ cfu/μg的感受態(tài)細(xì)胞,。如Yeasen的DH5α（cat NO. 11802ES）,，*0（cat NO. 11801ES）等。

Q：線性化載體和目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量和比例,？

A：載體使用量應(yīng)大于0.01 pmol,，推薦使用量0.03 pmol；克隆載體與目的片段摩爾比應(yīng)在2:1-1:5范圍內(nèi),，zui適為1:2-1:3,，超過范圍可能會影響克隆效率。

Q：一步法快速定向克隆試劑盒適用實驗有哪些,？

A：本試劑盒適用于絕大多數(shù)基于常規(guī)“酶切-連接”方法的克隆實驗,，并且特別適用于其它常規(guī)方法難以快速實現(xiàn)的基因多點突變、全基因合成等,。

Q：多片段一步法快速定向克隆試劑盒可以用于單片段的克隆嗎,？

A：多片段一步法克隆試劑盒可以用于單片段的克隆。但是,，單片段克隆試劑盒不建議用于多片段的克隆,，重組效率可能會受到影響。

Q：一步法快速定向克隆試劑盒反應(yīng)溫度是50℃,，是否可以在37℃進(jìn)行反應(yīng),？

A：一般情況下建議在50℃進(jìn)行反應(yīng),。50℃有利于消除DNA的二級結(jié)構(gòu)，同時是Hieff Clone^TM重組酶的zui適反應(yīng)溫度,。37℃反應(yīng)條件也可以進(jìn)行重組反應(yīng),，請根據(jù)實驗需要進(jìn)行優(yōu)化。

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