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活體成像試劑（D-Luciferin and Coelenterazine）
— — 生物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法（熒光素酶）
背  景：
活體成像技術(shù)（optical in vivo imaging）目前主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)，生物發(fā)光法是基于熒光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化學(xué)發(fā)光的原理,，將體外能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株植入動(dòng)物體內(nèi),，與后期注射入體內(nèi)的底物發(fā)生反應(yīng)，利用光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)光強(qiáng)度,，間接反映出細(xì)胞數(shù)量的變化或細(xì)胞的定位,。這項(xiàng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，zui常用的有腫瘤或疾病動(dòng)物模型的建立,，并可用于病毒學(xué)研究,、siRNA研究,、干細(xì)胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究等,。
原  理：
常見的熒光素酶有兩種,，分別是螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，編碼基因是luc）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase,，編碼基因是Rluc）,，前者的底物是D-Luciferin，后者的底物是Coelenterazine,。它們共同的作用原理是在ATP和熒光素酶的催化作用下,，底物被氧化發(fā)光（不同底物光的顏色和波長(zhǎng)不同），當(dāng)?shù)孜镞^量時(shí),，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性,。
產(chǎn)  品：
化學(xué)發(fā)光底物1：D-Luciferin
美國(guó)Goldbio公司提供幾種常用類型的D-Luciferin，每批試劑都經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量驗(yàn)證（經(jīng)9次獨(dú)立的HPLC和FTIR標(biāo)準(zhǔn)法監(jiān)測(cè)）和發(fā)光效率檢測(cè),，確?？蛻裘看卧囼?yàn)的高重復(fù)性和成功性。所有產(chǎn)品都可用于體內(nèi)成像分析和體外化學(xué)發(fā)光檢測(cè)實(shí)驗(yàn),。Goldbio的D-Luciferin是合成的螢火蟲熒光素,，結(jié)構(gòu)與promega公司提供的甲蟲熒光素一致，是水溶性的螢火蟲熒光素酶底物,。
（1）D-Luciferin, Sodium Salt/D熒光素鈉鹽
分子式：NaC₁₁H₇N₂O₃S₂·H₂O  分子量：320.32 g/mol   純度：純（99.7%）
應(yīng) 用：1）體外化學(xué)發(fā)光分析（in vitro）,；2）活體成像實(shí)驗(yàn)（in vivo）；3）高靈敏度ATP分析,；
步 驟：
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 體外生物發(fā)光檢測(cè)
1）用33.3 mL蒸餾水溶解1.0 gD-熒光素鈉鹽,，配制成100 mM的儲(chǔ)存液（200×，濃度30mg/ml）,?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。
2）用組織培養(yǎng)基1∶200稀釋儲(chǔ)存液,，配置工作液(終濃度150μg/mL),。
3）去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
4）待圖像分析前,，向細(xì)胞內(nèi)添加1×熒光素工作液,，然后進(jìn)行圖像分析。
Protocol 2：In vivo analysis / 活體成像分析
1）用無菌的PBS（w/o Mg2+,、Ca2+）配制D-熒光素鈉鹽工作液(15mg/mL),，0.2um濾膜過濾除菌。一旦使用，保持冰冷且避光,。
2）注射量取決于注射方式,，具體如下：

3）注射入體內(nèi)5-10分鐘后,，進(jìn)行成像分析,。
產(chǎn)品報(bào)價(jià)：

（2）D-Luciferin, Potassium Salt/D-熒光素鉀鹽;
分子式：NaC₁₁H₇N₂O₃S₂·H₂O    分子量：320.32 g/mol   純度：純（99.7%）
應(yīng)用：1）活細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)luc標(biāo)記基因和熒光素酶-融合基因體內(nèi)/體外表達(dá)的成像分析,；
       2）廣泛用于報(bào)告基因分析,，免疫分析和ATP熒光衛(wèi)生監(jiān)測(cè)分析；
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 體外生物發(fā)光檢測(cè)
1）配制成100 mM的儲(chǔ)存液（200×,，濃度30mg/ml）,。混勻后立即使用或分裝后-20℃凍存,。
2）用預(yù)熱好的組織培養(yǎng)基1∶200稀釋儲(chǔ)存液,，配制工作液(終濃度150μg/mL)。
3）去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基直至無殘留,。
4）圖像分析前立即向細(xì)胞內(nèi)添加1×熒光素工作液,，然后進(jìn)行圖像分析（或者細(xì)胞放在37℃短時(shí)間孵育后檢測(cè)可增強(qiáng)信號(hào)）。
Protocol 2：In vivo analysis in mice / 小鼠活體成像分析
1）用無菌的DPBS（w/o Mg2+,、Ca2+）配制D-熒光素鉀鹽溶液(15mg/mL)，0.2um濾膜過濾除菌,。一旦使用,，保持冰冷且避光。
2）按10 μL/g體重的濃度向每支小鼠注射相應(yīng)量的15mg/mL熒光素溶液,；
3）腹腔注射10-15 min后進(jìn)行成像分析,。（對(duì)每只動(dòng)物模型做熒光素動(dòng)力學(xué)研究以確定峰值信號(hào)獲取時(shí)間）
產(chǎn)品報(bào)價(jià)：

（3）D-Luciferin Firefly,free acid/D-螢火蟲熒光素
分子式：C₁₁H₈N₂O₃S₂  分子量：280.330 g/mol  外觀：白色至淺黃色粉末
溶解：0.25%濃度溶解于甲醇，形成近乎無色至淺黃色的清夜
保存：-15°C 避光
應(yīng)用：1）活細(xì)胞,、組織或生物體內(nèi)luc標(biāo)記基因和熒光素酶-融合基因體內(nèi)/體外表達(dá)的成像分析,；
      2）廣泛用于報(bào)告基因分析，免疫分析和ATP熒光衛(wèi)生監(jiān)測(cè)分析,；
產(chǎn)品報(bào)價(jià)：

使用GBT公司熒光素（Luciferin）發(fā)表的文獻(xiàn):
1. Barth et al. Molecular Therapy. 2008, 16. 957-964.
2. Mahller et al. Cancer Research. 2008, 68 (4). 1170-1179.
3. Marques et al. Journal of Neurovirology. 2008, 14 (3). 229-238.
4. Stish et al. J. Neurooncol. 2008, 61 (1). 51-61.
5. Zhang et al. Cancer Research. 2007, 67. 9389-9397. 6. Baia, G. et al, Brain Pathology, 2007, 18 (2), 172-179.
7. Barth, A. et al, Molecular Therapy, 2008, 16 (5), 957-964.
8. Su Y. et al. Clinical and Experimental Metastasis, 2009
化學(xué)發(fā)光底物2：Coelenterazine
美國(guó)Goldbio提供三種coelenterazine類似物,，分別是Coelenterazine，Coelenterazineh,，Coelenterazine 400a,。雖然三種都可用于相同實(shí)驗(yàn)，但是得到的結(jié)果有差異。
Coelenterazine：普遍認(rèn)為是天然的腔腸熒光素,，是海腎熒光素酶（Rluc）的作用底物,，具有許多用途?？捎糜跈z測(cè)活細(xì)胞中鈣離子濃度,，基因報(bào)告分析，BRET（生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移）研究,，ELISA,，HTS，組織或細(xì)胞中超氧陰離子和過亞硝酸鹽的化學(xué)發(fā)光檢測(cè),。
Coelenterazine h:與Renilla熒光素酶或Gaussia熒光素酶使用具有一定的局限性,。體外研究中比其他類似物更適合與鈣離子激活發(fā)光蛋白共用。據(jù)報(bào)道,，Coelenterazine h的發(fā)光強(qiáng)度高于天然腔腸熒光素10-20倍,，因此是用來檢測(cè)鈣離子濃度微小變化的有力工具。
Coelenterazine 400a: 是BRET研究中Rluc的底物,，此腔腸素衍生物在390 nm和400nm之間發(fā)藍(lán)色光,，對(duì)GFP acceptor的光發(fā)射干擾zui小。
（1）Coelenterazine（天然腔腸熒光素）
分子式：C₂₆H₂₁N₃O₃    分子量: 423.48 g/mol   純度：95%  保存：-15°C避光,，保存在惰性氣體下
Protocol：發(fā)光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
1）使用管光度計(jì)室溫下定量檢測(cè)發(fā)光情況,，每個(gè)樣品做三個(gè)平行；
2）加入底物10s內(nèi)立即檢測(cè),，“integration time”為1 s,；
3）對(duì)于細(xì)菌表達(dá)Gluc系統(tǒng)，甲醇溶解底物腔腸素制備10 mM儲(chǔ)存液,，終濃度為10μmol/L,。儲(chǔ)存液-20 °C保存，工作液制備過程需避光并置于冰上,。
產(chǎn)品報(bào)價(jià)：

（2）Coelenterazine 400 a/腔腸素400a
分子式：C₂₆H₂₁N₃O   分子量：: 391.48 g/mol     純度：95%
儲(chǔ)存液制備：
1）開封前將瓶子放到室溫溫育,，以避免產(chǎn)品發(fā)生任何的冷凝；
2）用125 μL無水乙醇溶解50 μg Coelenterazine 400 a,，zui終濃度是0.4μg/μL. ,，輕輕混勻；（注：避免用DMSO或其他溶劑來溶解腔腸素400a,，因?yàn)樵噭┛赡鼙谎趸?/span>
3）分裝后避光保存在-20°C,，保持干燥；
產(chǎn)品報(bào)價(jià)：

（3）Coelenterazine h/ 腔腸素h（from Caliper LifeScience Inc.）
RediJectCoelenterazineh為即用的注射型生物發(fā)光底物,，特別設(shè)計(jì)用于體內(nèi)成像研究,。通過zui小化產(chǎn)品成分的變化,，zui小化凍融次數(shù)和嚴(yán)格控制不同批次的產(chǎn)品，使用Caliper公司的Coelenterazine h能確?？蛻舻玫礁咧貜?fù)性的結(jié)果,。
優(yōu)  點(diǎn)：
◆預(yù)制配方，不同批次間嚴(yán)格控制特別設(shè)計(jì)用于體內(nèi)研究,；
◆即用型產(chǎn)品通過zui小化預(yù)成像準(zhǔn)備步驟,，減少時(shí)間和精力；
◆每瓶可用于5只動(dòng)物的成像研究,；（10 瓶/kit）
◆經(jīng)IVIS成像系統(tǒng)驗(yàn)證,，控制體內(nèi)成像質(zhì)量；
顏色：黃色溶液（溶于丙二醇/檸檬酸鹽）
濃度：150 μg/mL （10瓶無菌溶液,，每瓶含1.2 mL濃度為150 μg/mL的Coelenterazine h ）
保存： Store at ≤ -70 °C,。
使用及注射劑量：
開始實(shí)驗(yàn)前，37 °C水浴鍋解凍,，避免重復(fù)凍融,。靜脈注射(i.v.)或腹腔注射(i.p.)。

1. 靜脈注射：推薦使用劑量15 μg/mouse(100 μL/mouse）,，用1 ml注射器直接從瓶?jī)?nèi)吸取溶液,，然后用25 gauge或更高的針頭注射入小鼠體內(nèi)。盡快成像檢測(cè)以獲得峰值信號(hào),。
2. 腹腔注射：推薦劑量是30 μg/mouse (200 μL/mouse),，方法同上。

應(yīng)用實(shí)例：
   
                                      
Figure 1. RedijectCoelenterazine has been optimized for in vivo use with IVISimaging systems. (A) 5 pmol BRET Qdot 700* were injected intravenouslyin a nu/nu mouse. 10 minutes post BRET Qdot injection 15 μg/mouseCoelenterazine h was injected intravenously. Chart shows peak signal wasobserved right after injection at ~ 22 seconds followed by rapidclearance. Images were taken with IVIS kinectic. (B) 1,2 and 4 pmol BRETQdot 655 were injected subcutaneously in a nu/nu mouse. 10 minutes postBRET Qdot injection 10 μg/mouse Coelenterazine was injectedintraperitoneally. Chart shows that peak signal was reached around 27minutes post i.p. injection of Coelenterazine.
產(chǎn)品報(bào)價(jià)：