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產(chǎn)品信息：

產(chǎn)品描述

細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶,，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA,。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder。 

TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（FITC）可以用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡晚期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況,。其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下,，在基因組DNA斷裂時(shí)暴露出的3´-羥基（3´-OH）末端摻入FITC-12-dUTP，從而可以用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè),。

本試劑盒對(duì)標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化,，采用*比例的FITC-12-dUTP和未標(biāo)記dNTP進(jìn)行3’-OH末端的核苷酸摻入，使得同一個(gè)斷裂的DNA段末端可以形成更長(zhǎng)的“標(biāo)記尾巴”,。該“標(biāo)記尾巴”減少了相鄰摻入dNTP上標(biāo)記基團(tuán)的空間位阻,，增加每個(gè)斷裂片段上的熒光基團(tuán)數(shù)目，降低熒光基團(tuán)相鄰后可能造成的聚集和淬滅,，從而提高檢測(cè)靈敏度,，減少非特異性反應(yīng)。

本試劑盒應(yīng)用范圍廣,，可以用于檢測(cè)冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況,，也可以檢測(cè)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸,。

本試劑盒儲(chǔ)存在-20℃,，FITC-12-dUTP Labling Mix避光儲(chǔ)存于-20℃，保質(zhì)期為一年,。

 操作步驟

一,、樣品準(zhǔn)備

A．  石蠟包埋組織切片

1.          室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5min，重復(fù)一次,，以*脫掉石蠟,。

2.          室溫下用100%乙醇浸泡切片5min，重復(fù)一次,。

3.          室溫下用梯度乙醇（90,、80、70%）各浸洗1次,，每次3min,。

4.          用PBS輕輕潤(rùn)洗切片，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體,。這時(shí),，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作,。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn),。

5.          配制Proteinase K工作液：按1:100的比例,，用PBS作為稀釋液來(lái)稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液,，使其終濃度為20μg/ml。

6.          每個(gè)樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液,，使其被全部覆蓋,，室溫孵育20min。

注意：Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對(duì)后續(xù)步驟的染色試劑通透,。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn),，過(guò)短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率,。未得到更好的結(jié)果,，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間。

7.          用PBS溶液潤(rùn)洗樣本,，輕輕去掉多余液體,，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤(rùn),。

B．  組織冰凍切片

1.          將玻片浸沒(méi)在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中固定,，室溫下孵育15min。

2.          輕輕去掉多余液體,，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體,。

3.          將玻片浸沒(méi)在PBS溶液中，室溫孵育15min,。

4.          輕輕去掉多余液體,，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時(shí),，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓,，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,，切勿讓樣品干燥,，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn)。

5.          配制Proteinase K工作液：按1:100的比例,，用PBS作為稀釋液來(lái)稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液,，使其終濃度為20μg/ml。

6.          每個(gè)樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液,，使其被全部覆蓋，室溫孵育10min,。

7.          注意：Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對(duì)后續(xù)步驟的染色試劑通透,。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn)，過(guò)短則可能造成透性處理不充分,，影響標(biāo)記效率,。未得到更好的結(jié)果,，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間。

8.          用PBS溶液潤(rùn)洗樣本2-3次,。

9.          輕輕去掉多余液體,，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤(rùn),。

C．  細(xì)胞爬片的準(zhǔn)備

在Lab-Tek載波片小室（Chamber Slides）上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞,。在凋亡誘導(dǎo)處理之后，用PBS洗2遍載玻片,。

D．  細(xì)胞涂片的制備

1.          準(zhǔn)備多聚賴氨酸包被的載玻片：吸取50–100 μl 0.01% (W/V)多聚賴氨酸水溶液,，滴至每一片預(yù)清洗過(guò)的玻璃載玻片的表面。在將要用于固定細(xì)胞的區(qū)域?qū)⒍嗑圪嚢彼崛芤和可橐槐?。待載玻片晾干之后,，迅速用去離子水漂洗，然后讓包被后的載玻片在空氣中晾干30-60分鐘,。包被后的載玻片能在室溫儲(chǔ)存數(shù)月,。

2.          以約2×10⁷個(gè)細(xì)胞/ml的濃度將細(xì)胞重懸于PBS中，吸取50-100μl細(xì)胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上,，用一片干凈的載玻片輕柔的涂開(kāi)細(xì)胞懸液,。

3.          固定細(xì)胞，將載玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中,，在4℃放置25min,。

4.          洗滌載玻片，將其浸入PBS中,，室溫放置5min,。重復(fù)用PBS洗一次。

5.          輕輕去掉多余液體,，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體,。這時(shí)，可用石蠟筆或指甲油在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓,，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作,。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，切勿讓樣品干燥,，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤(rùn),。

6.          配制Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來(lái)稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液,，使其終濃度為20μg/ml,。

7.          每個(gè)樣本上滴加100μl上述Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋,，室溫孵育5min（也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中,，室溫孵育5min進(jìn)行通透處理）,。

注意：Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對(duì)后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn),，過(guò)短則可能造成透性處理不充分,，影響標(biāo)記效率。未得到更好的結(jié)果,，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間,。

8.          在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒(méi)清洗樣本2-3次。

9.          輕輕去掉多余液體,，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤(rùn)。

二,、DNA酶處理陽(yáng)性對(duì)照的步驟（可選）

在樣本通透處理后,，用DNA酶I處理細(xì)胞來(lái)準(zhǔn)備陽(yáng)性對(duì)照載玻片。DNA酶I處理固定的細(xì)胞會(huì)引起染色體DNA的斷裂,，產(chǎn)生許多可標(biāo)記的DNA 3’-末端,。該流程通常會(huì)引起被處理的大多數(shù)細(xì)胞顯現(xiàn)綠色熒光。

1.          加入100μl DNA酶I緩沖液到固定的細(xì)胞中,，室溫孵育5min,。

2.          輕叩掉液體，加入100μl含5.5-10 units/ml DNA酶I的緩沖液,，室溫孵育10min,。

3.          輕叩載玻片去掉多余的液體，并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中*洗3-4次,。

注意：陽(yáng)性對(duì)照載玻片必須使用單獨(dú)的染色缸,，否則，來(lái)自陽(yáng)性對(duì)照載玻片上殘余的DNA酶I活性可能會(huì)在實(shí)驗(yàn)載玻片上引入高的背景,。

三,、標(biāo)記與檢測(cè)

1.          按1:5的比例用去離子水稀釋5×Equilibration Buffer。

2.          每個(gè)樣本滴加100μl 1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域,，室溫孵育10-30分鐘,。或者將載玻片放入一個(gè)含有1×Equilibration Buffer的缸中,，保證緩沖液沒(méi)過(guò)樣本,。在平衡細(xì)胞的同時(shí)在冰上解凍FITC-12-dUTP Labling Mix，并且依照表1,，準(zhǔn)備足夠量的用于所有實(shí)驗(yàn)的和可選陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液,。對(duì)于面積小于5cm²的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)，其體積是50μl，用50μl乘以實(shí)驗(yàn)和陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的數(shù)目來(lái)確定所需TdT孵育緩沖液的總體積,。對(duì)于表面積更大的樣本，可成比例的增大試劑體積,。

表1. 準(zhǔn)備用于實(shí)驗(yàn)的和可選陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液

陰性對(duì)照體系：準(zhǔn)備一份不含TdT酶的對(duì)照孵育緩沖液,，用ddH₂O替代TdT酶。

3.          在平衡后的區(qū)域周圍用吸水紙洗掉100μl 1×Equilibration Buffer中的大部分,，然后在5cm2面積的細(xì)胞上加入50μlTdT孵育緩沖液,。不要讓細(xì)胞干掉。這之后的操作,，載玻片要避光,。

4.          把塑料蓋玻片蓋在細(xì)胞上以保證試劑的平均分布，在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾,。將載玻片置于濕盒內(nèi),，在37℃孵育60min。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光,。

注意：塑料蓋玻片在使用前可以切成兩半,。折起蓋玻片的邊緣以便于移除和操作。

5.          移除塑料蓋玻片,，并將切片置于PBS溶液中室溫孵育5min,。

6.          輕輕去掉多余液體，換用新鮮的PBS溶液室溫孵育5 min,，重復(fù)一次,。

7.          用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。注意：為了降低背景,，載玻片在用PBS洗一遍后,，可再用含0.1%Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗3次，每次5min,，這樣可將游離的未反應(yīng)標(biāo)記物清除干凈,。

8.          樣本在染色缸中染色，在黑暗中將載玻片浸入裝有PI溶液（1μg/ml,，用PBS新鮮配制并稀釋）的染色缸,，室溫放置5min?？蛇x操作：樣本在染色缸中染色,，在黑暗中將載玻片浸入裝有DAPI溶液（2μg/ml，用PBS新鮮配制并稀釋）的染色缸,，室溫放置5min,。

9.          洗滌樣本，將載玻片浸入去離子水中，室溫放置5min,，重復(fù)2次,，總共洗3次。

10.       叩干載玻片上多余的水并且用吸水紙擦拭細(xì)胞周邊的區(qū)域,。

11.       立即在熒光顯微鏡下分析樣本,，用標(biāo)準(zhǔn)的熒光過(guò)濾裝置在520±20nm的熒光下觀察綠色熒光；在＞620nm下觀察PI的紅色熒光,，或在460nm觀察藍(lán)色的DAPI,。如有必要，載玻片能在4℃黑暗條件下