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產(chǎn)品信息：

產(chǎn)品描述

細胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶,，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA,。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測,，可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder,。 

TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)細胞凋亡檢測試劑盒（FITC）可以用來檢測組織細胞在凋亡晚期過程中細胞核DNA的斷裂情況,。其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，在基因組DNA斷裂時暴露出的3´-羥基（3´-OH）末端摻入FITC-12-dUTP,，從而可以用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。

本試劑盒對標記反應進行了優(yōu)化,，采用*比例的FITC-12-dUTP和未標記dNTP進行3’-OH末端的核苷酸摻入,，使得同一個斷裂的DNA段末端可以形成更長的“標記尾巴”。該“標記尾巴”減少了相鄰摻入dNTP上標記基團的空間位阻,，增加每個斷裂片段上的熒光基團數(shù)目,，降低熒光基團相鄰后可能造成的聚集和淬滅，從而提高檢測靈敏度，減少非特異性反應,。

本試劑盒應用范圍廣,，可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可以檢測培養(yǎng)的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況,。

產(chǎn)品組分

運輸與保存方法

冰袋（wet ice）運輸,。

本試劑盒儲存在-20℃，FITC-12-dUTP Labling Mix避光儲存于-20℃,，保質期為一年,。

 操作步驟

一、樣品準備

A．  石蠟包埋組織切片

1.          室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5min,，重復一次,，以*脫掉石蠟。

2.          室溫下用100%乙醇浸泡切片5min,，重復一次,。

3.          室溫下用梯度乙醇（90、80,、70%）各浸洗1次,，每次3min。

4.          用PBS輕輕潤洗切片,，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體,。這時，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓,，便于下游透性處理和平衡標記操作,。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥,，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤,。

5.          配制Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液,，使其終濃度為20μg/ml,。

6.          每個樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液，使其被全部覆蓋,，室溫孵育20min,。

注意：Proteinase K幫助組織和細胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險,，過短則可能造成透性處理不充分,，影響標記效率。未得到更好的結果,，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間,。

7.          用PBS溶液潤洗樣本,，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤,。

B．  組織冰凍切片

1.          將玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中固定，室溫下孵育15min,。

2.          輕輕去掉多余液體,，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。

3.          將玻片浸沒在PBS溶液中,，室溫孵育15min,。

4.          輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體,。這時,，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作,。在實驗過程中,，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤,。

5.          配制Proteinase K工作液：按1:100的比例,，用PBS作為稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為20μg/ml,。

6.          每個樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液,，使其被全部覆蓋，室溫孵育10min,。

7.          注意：Proteinase K幫助組織和細胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透,。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分,，影響標記效率,。未得到更好的結果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間,。

8.          用PBS溶液潤洗樣本2-3次,。

9.          輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤,。

C．  細胞爬片的準備

在Lab-Tek載波片小室（Chamber Slides）上培養(yǎng)貼壁細胞。在凋亡誘導處理之后,，用PBS洗2遍載玻片,。

D．  細胞涂片的制備

1.          準備多聚賴氨酸包被的載玻片：吸取50–100 μl 0.01% (W/V)多聚賴氨酸水溶液，滴至每一片預清洗過的玻璃載玻片的表面,。在將要用于固定細胞的區(qū)域將多聚賴氨酸溶液涂散為一薄層,。待載玻片晾干之后，迅速用去離子水漂洗,，然后讓包被后的載玻片在空氣中晾干30-60分鐘,。包被后的載玻片能在室溫儲存數(shù)月。

2.          以約2×10⁷個細胞/ml的濃度將細胞重懸于PBS中,，吸取50-100μl細胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上,，用一片干凈的載玻片輕柔的涂開細胞懸液。

3.          固定細胞,，將載玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中,，在4℃放置25min。

4.          洗滌載玻片,，將其浸入PBS中,，室溫放置5min。重復用PBS洗一次,。

5.          輕輕去掉多余液體,，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時,，可用石蠟筆或指甲油在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓,，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中,，切勿讓樣品干燥,，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

6.          配制Proteinase K工作液：按1:100的比例,，用PBS作為稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液,，使其終濃度為20μg/ml。

7.          每個樣本上滴加100μl上述Proteinase K溶液,，使其被全部覆蓋,，室溫孵育5min（也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中，室溫孵育5min進行通透處理）,。

注意：Proteinase K幫助組織和細胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透,。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分,，影響標記效率,。未得到更好的結果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間,。

8.          在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次,。

9.          輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤,。

二,、DNA酶處理陽性對照的步驟（可選）

在樣本通透處理后，用DNA酶I處理細胞來準備陽性對照載玻片,。DNA酶I處理固定的細胞會引起染色體DNA的斷裂,，產(chǎn)生許多可標記的DNA 3’-末端。該流程通常會引起被處理的大多數(shù)細胞顯現(xiàn)綠色熒光,。

1.          加入100μl DNA酶I緩沖液到固定的細胞中,，室溫孵育5min。

2.          輕叩掉液體,，加入100μl含5.5-10 units/ml DNA酶I的緩沖液,，室溫孵育10min。

3.          輕叩載玻片去掉多余的液體,，并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中*洗3-4次,。

注意：陽性對照載玻片必須使用單獨的染色缸，否則,，來自陽性對照載玻片上殘余的DNA酶I活性可能會在實驗載玻片上引入高的背景,。

三、標記與檢測

1.          按1:5的比例用去離子水稀釋5×Equilibration Buffer,。

2.          每個樣本滴加100μl 1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域,，室溫孵育10-30分鐘?；蛘邔⑤d玻片放入一個含有1×Equilibration Buffer的缸中,，保證緩沖液沒過樣本。在平衡細胞的同時在冰上解凍FITC-12-dUTP Labling Mix,，并且依照表1,，準備足夠量的用于所有實驗的和可選陽性對照反應的TdT孵育緩沖液。對于面積小于5cm²的一個標準反應,，其體積是50μl,，用50μl乘以實驗和陽性對照反應的數(shù)目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積。對于表面積更大的樣本,，可成比例的增大試劑體積,。

表1. 準備用于實驗的和可選陽性對照反應的TdT孵育緩沖液

陰性對照體系：準備一份不含TdT酶的對照孵育緩沖液，用ddH₂O替代TdT酶,。

3.          在平衡后的區(qū)域周圍用吸水紙洗掉100μl 1×Equilibration Buffer中的大部分,，然后在5cm2面積的細胞上加入50μlTdT孵育緩沖液。不要讓細胞干掉,。這之后的操作,，載玻片要避光。

4.          把塑料蓋玻片蓋在細胞上以保證試劑的平均分布,，在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾,。將載玻片置于濕盒內(nèi),，在37℃孵育60min。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光,。

注意：塑料蓋玻片在使用前可以切成兩半,。折起蓋玻片的邊緣以便于移除和操作。

5.          移除塑料蓋玻片,，并將切片置于PBS溶液中室溫孵育5min。

6.          輕輕去掉多余液體,，換用新鮮的PBS溶液室溫孵育5 min,，重復一次。

7.          用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液,。注意：為了降低背景,，載玻片在用PBS洗一遍后，可再用含0.1%Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗3次,，每次5min,，這樣可將游離的未反應標記物清除干凈。

8.          樣本在染色缸中染色,，在黑暗中將載玻片浸入裝有PI溶液（1μg/ml,，用PBS新鮮配制并稀釋）的染色缸，室溫放置5min,?？蛇x操作：樣本在染色缸中染色，在黑暗中將載玻片浸入裝有DAPI溶液（2μg/ml,，用PBS新鮮配制并稀釋）的染色缸,，室溫放置5min。

9.          洗滌樣本,，將載玻片浸入去離子水中,，室溫放置5min，重復2次,，總共洗3次,。

10.       叩干載玻片上多余的水并且用吸水紙擦拭細胞周邊的區(qū)域。

11.       立即在熒光顯微鏡下分析樣本,，用標準的熒光過濾裝置在520±20nm的熒光下觀察綠色熒光,；在＞620nm下觀察PI的紅色熒光，或在460nm觀察藍色的DAPI,。如有必要,，載玻片能在4℃黑暗條件下