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☆在完整的RNA和降解的RNA樣本中，檢測的基因的Ct值是穩(wěn)定的嗎,？
☆如果基因表達差異倍數不大,，與RNA降解有關嗎？
☆內參基因的作用：降低RNA降解對qPCR的影響
☆引物的選擇：擴增合適大小的目的片段
基因定量包含逆轉錄和定量PCR,，獲得高純度,、降解程度低的RNA，對于其后的反轉,、定量結果,，自然是非常重要的。
一,、RNA完整性（RNA integrity）
RNA的降解程度可根據RIN值來評定,，該值由Aligent 2100儀器測定。將RNA完整性分為10級,，用數字1,、2、3……8,、9,、10表示,。RIN值越接近10，RNA完整性越好,；RIN值越接近1,，RNA降解越嚴重。
就降解程度而言,，來源于組織的RNA較細胞嚴重,。RNA完整性與樣本的組成（內源性RNase含量）、保存,、處理過程（處理難易程度）,、處理時間（處理速度）有關。較堅硬,、較難處理的樣本（如瘤胃,、空腸），獲得的RNA的RIN值越小,，且不同樣本間重復性差,。
二、RNA發(fā)生降解后,，qPCR定量的Ct值變大
Corpus luteum來源的RNA經酶消化處理或紫外線照射,，獲得不同降解程度的RNA。之后,，對18S rRNA,、28S rRNA、β-actin及IL-1β定量,。
我們可以看到：
1,、不論是高豐度表達基因（18S rRNA、28S rRNA,、β-actin）或低豐度表達基因（IL-1β）,，RNA降解程度越高，Ct值越大,；RNA完整性越好,，Ct值越小。
2,、RNA質量越好,，Ct值波動越小，qPCR實驗的重復性也越好,。
三,、RNA發(fā)生降解后，定量結果不可控
進行基因表達量分析時，可通過選擇內參基因嘗試消除樣本間模板量的差異,。RNA的降解可認為是RNA“穩(wěn)態(tài)”的變化,，引入內參基因校正樣本不同降解程度的差異。那么經內參（β-actin）校正后的基因（18S rRNA,、28S rRNA,、IL-1β）的qPCR檢測結果即△Ct值變化情況如何呢？
可以看出：1,、內參基因（β-actin）校正后,，RNA降解前后，△Ct值變化較Ct值變化小,。
2,、經內參基因校正后，對于一些基因（28S rRNA）,，RNA降解前后,，△Ct值依舊會出現“小的”變化。
因此,，RNA模板發(fā)生降解,，利用相對定量PCR可以定量基因表達的趨勢,，而進行定量需謹慎,！因此，基因表達差異倍數不大時,，需評估RNA質量,。
四、從RNA完整性角度解釋：qPCR定量,，擴增產物長度控制在70-250bp
RNA降解程度與qPCR擴增基因的長度呈現一定的關系：70-250bp,，RNA完整性越高，Ct值越小,，呈現線性關系,。而＞400bp，RNA完整性與Ct值之間無明顯相關性,。因此,，RNA模板發(fā)生部分降解，對于＞400bp以上的目的基因,，無法利用相對定量進行定性分析,。
RNA發(fā)生降解，會影響qPCR的Ct值,，導致定量數據的重復性差,。即使使用內參基因校正，依舊會造成定量結果出現誤差，不能反應樣本間的基因表達量的差異,。但是當降解不嚴重時,，還是可以用于基因的定性分析。
小編碼了這么多字,，其實就是想說“作為模板的RNA,，它的完整性對于做好qPCR實驗很有意義”，畢竟RNA是容易降解的,。
參考文獻
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