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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級(jí)會(huì)員·13年您現(xiàn)在的位置： 首頁(yè)> 技術(shù)文章 > 干貨 | 實(shí)驗(yàn)室新寵,！這個(gè)PCR試劑竟把實(shí)際上機(jī)時(shí)間壓到60分鐘內(nèi),？
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各擴(kuò)增酶實(shí)際上機(jī)用時(shí)總時(shí)長(zhǎng)（包含PCR儀升溫,、降溫過程）,。
10167ES擴(kuò)增3 kb片段上機(jī)時(shí)間僅需59 min！30循環(huán)下,，6 kb片段上機(jī)僅需58 min,！相比市面上其他產(chǎn)品，最高立省3.7小時(shí),！
以下更有詳細(xì)實(shí)驗(yàn)操作解析,，今日免費(fèi)公開！助力實(shí)驗(yàn)黨高效完成實(shí)驗(yàn),！
實(shí)驗(yàn)材料：
DNA樣本：大腸桿菌菌落,、大腸桿菌菌液、農(nóng)桿菌菌落,、酵母菌落,、小鼠基因組DNA、玉米基因組DNA、水稻基因組DNA,。
快速PCR試劑：2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix（Cat#10167ES）,。
其他試劑：RNase-free H2O或DEPC處理水、相關(guān)基因上下游引物(儲(chǔ)存濃度10 μM),。
設(shè)備與耗材：移液器,、PCR儀、冰盒,、離心機(jī),、EP管、RNase-free離心管,。
實(shí)驗(yàn)步驟：
試劑&樣本前期準(zhǔn)備
試劑解凍和混勻
從冰箱中取出：
從-20℃冰箱中取出含酶試劑,，立即放入冰盒中（冰上操作）。
避免將試劑直接放在室溫下解凍,，以免溫度波動(dòng)影響酶的活性,。
緩慢解凍：
讓試劑在冰上自然解凍，通常需要5-10分鐘,。
如果需要快速解凍,，可以將試劑握在手中輕輕搖晃，但不要過度加熱,。
低速離心：
PCR Mix在1×預(yù)混液中含有2 mM Mg2+和200 μM的dNTPs,，使用前要充分解凍混勻。
將試劑管短暫離心（5-10秒,，1000 rpm左右）,，使管壁和管蓋上的液體集中到管底。
離心后置于渦旋儀震蕩10 sec混勻,，確保試劑均勻分布,。
混勻后的試劑應(yīng)繼續(xù)放在冰上，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在室溫下,。
如溶解后,，暫未使用,，可暫時(shí)儲(chǔ)存于4度放置,。
Tips：混勻時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，氣泡可能會(huì)影響酶的活性或?qū)嶒?yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
模板稀釋（若需要）
以下是針對(duì)不同模板,，PCR反應(yīng)時(shí)推薦的使用量：
用無菌超純水稀釋DNA或者線性化載體至目標(biāo)濃度。
Tips：模板DNA在儲(chǔ)存的過程中會(huì)有一定程度的降解,，儲(chǔ)存前測(cè)試的濃度不一定準(zhǔn)確,，為了保證實(shí)驗(yàn)精度，在放置一段時(shí)間后,，需重新測(cè)試DNA模板濃度,。
不同模板擴(kuò)增1 kb目的片段比對(duì)測(cè)試
以大腸桿菌菌落,、農(nóng)桿菌菌落為模板：盡量使用新鮮長(zhǎng)滿的平板，大腸桿菌,、農(nóng)桿菌平板4度存放不得超過45天,。
以大腸桿菌菌液為模板：使用新鮮搖菌的大腸桿菌菌液。挑取單菌落至1 mL液體培養(yǎng)基中,，37℃搖床180 rpm培養(yǎng)3-4 h,，至菌液渾濁但偏澄清的狀態(tài)，使用分光光度計(jì)測(cè)試OD600下的菌液濃度,，OD600=0.5-0.6最佳,。
Tips：OD600不宜超過1.2，菌液太濃會(huì)抑制擴(kuò)增,。
以小鼠,、玉米、水稻基因組DNA為模板：根據(jù)10167ES說明書中基因組添加量進(jìn)行樣本稀釋,，本實(shí)驗(yàn)預(yù)計(jì)添加的樣本量為100 ng,，將基因組DNA均稀釋為50 ng/μL。
加樣順序：RNase-free H2O＞引物＞模板＞PCR Mix,。
引物作為反復(fù)凍融使用的材料,，在使用過程中易造成污染，導(dǎo)致非特異擴(kuò)增,。所以建議引物作為ddH2O之后優(yōu)先添加的材料,，防止因槍頭未更換等因素污染引物。
菌落挑取方法：在環(huán)境中用10 μL槍頭蘸取菌落后,，槍頭插入溶液中,，移液器按鈕從第一檔按至第二檔打出，反復(fù)吹打三次,，確保菌落加入反應(yīng)體系,。（在透明的水中含有些微白色物質(zhì)，即可確認(rèn)菌落已加至反應(yīng)體系中,。）
菌液加樣方法：加樣前需上下顛倒混勻,，用200 μL槍頭吹打混勻。
PCR反應(yīng)體系：
試劑混勻
配制完成后,，用桌面離心機(jī)瞬離所有試劑到管底,，然后渦旋10 sec振蕩混勻，若期間有氣泡,，要將氣泡輕輕指彈震裂,，離心10 sec后立即上機(jī)。
若暫時(shí)不能上機(jī)，可于-20℃暫存1 h,。
各擴(kuò)增酶Mix PCR反應(yīng)程序
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10167ES反應(yīng)程序
P*反應(yīng)程序
N*反應(yīng)程序
V*反應(yīng)程序
T*反應(yīng)程序
*推薦退火溫度：60°C,，也可根據(jù)自身需要設(shè)立溫度梯度摸索引物退火的最適溫度。推薦退火時(shí)間設(shè)置為20 sec,，可以在10-30 sec內(nèi)調(diào)節(jié),。但需注意退火時(shí)間過長(zhǎng)可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物在膠上呈彌散狀。
**延伸速度設(shè)置可參考下表：本次擴(kuò)增目的片段均為1 kb左右,，因此設(shè)置為1 sec/kb,。
如需提高產(chǎn)量可適當(dāng)延長(zhǎng)延伸時(shí)間，不宜超過30 sec/kb,。
***循環(huán)數(shù)可設(shè)置為30-35個(gè)循環(huán),。無需再增加循環(huán)數(shù)。因?yàn)檫^多的循環(huán)雖然能增加產(chǎn)物量,，但會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增和假陽性的風(fēng)險(xiǎn),。
Tips：隨著副產(chǎn)物的積累以及試劑的消耗，即使再增加循環(huán)數(shù),，PCR產(chǎn)物量也不會(huì)再有明顯增加,，出現(xiàn)擴(kuò)增無法持續(xù)的停滯現(xiàn)象。10167ES試劑可以抑制【擴(kuò)增無法持續(xù)的停滯現(xiàn)象】,，無需再增加循環(huán)數(shù),，即可獲得高得率的PCR產(chǎn)物。
凝膠電泳
配制1%瓊脂糖凝膠插小孔梳,，PCR完成后,，吸取6 μL反應(yīng)液上樣（翌圣PCR試劑已含有紅色示蹤染料，無需添加loading buffer,，可直接上樣）,。Marker使用GoldBand DL10,000 DNA Marker（10505ES），上樣4 μL,。150 V電泳30 min,，觀察電泳條帶。
Tips：移液槍斜角45°懸空插入膠孔中,，緩慢加樣,，確保玫紅色的PCR產(chǎn)物沉入膠孔中。避免戳破膠孔底部,，導(dǎo)致樣品滲漏,?？奢p微晃動(dòng)電泳槽觀察凝膠是否漏液,。
電泳結(jié)果
注：1：大腸桿菌菌落；2：大腸桿菌菌液；3：小鼠基因組DNA,；4：玉米基因組DNA,；5：水稻基因組DNA；6：農(nóng)桿菌菌落,。
結(jié)果顯示,，翌圣快速PCR試劑（10167ES）性能優(yōu)于市面上其他競(jìng)品，擴(kuò)增速度快,，檢出率高,，擴(kuò)增產(chǎn)量高。
以酵母菌為模板擴(kuò)增3 kb目的片段比對(duì)測(cè)試
樣本前處理
用10 μL槍頭挑取酵母菌平板上的單菌落,，在裝有50 μL無菌水的1.5 mL離心管中吹打三次,，放入微波爐高火加熱5 min，立刻用鑷子夾取至-80℃冰箱冷卻,，即獲得酵母菌前處理液,。
酵母菌前處理液可以放在4度保存7天。
酵母菌平板在4度存放不得超過45天,。
PCR加樣
加樣順序：RNase-free H2O＞引物＞酵母菌前處理液＞PCR Mix,。
菌液加樣方法：盡量使用新鮮處理的酵母前處理液，加樣前需解凍,，震蕩10 sec混勻,。
PCR反應(yīng)體系：
試劑混勻
配制完成后，用桌面離心機(jī)瞬離所有試劑到管底,，然后渦旋10 sec振蕩混勻,，若期間有氣泡，要將氣泡輕輕指彈震裂,，離心10 sec后立即上機(jī),。
若暫時(shí)不能上機(jī)，可于-20℃暫存1 h,。
PCR反應(yīng)程序
（同3.“各擴(kuò)增酶Mix PCR反應(yīng)程序"）,，本次擴(kuò)增目的片段為3 kb左右復(fù)雜模板，因此翌圣快速PCR（Cat#10167ES）延伸速度設(shè)置為1 sec/kb,。
凝膠電泳
配制1%瓊脂糖凝膠插小孔梳,，PCR完成后，吸取6 μL反應(yīng)液上樣,。Marker使用GoldBand DL10,000 DNA Marker（10505ES）,，上樣4 μL。150 V電泳30 min,，觀察電泳條帶,。
電泳結(jié)果
結(jié)果顯示,，翌圣快速PCR試劑（10167ES）酵母擴(kuò)增性能優(yōu)于市面上其他競(jìng)品，擴(kuò)增速度快,，檢出率高,，擴(kuò)增產(chǎn)量高。
產(chǎn)品推薦：
產(chǎn)品定位 | 名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
快速PCR升級(jí),，可菌P且適用復(fù)雜模板擴(kuò)增 | 2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix | 10167ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
1-7片段一步法定向連接,，最快5分鐘完成重組反應(yīng) | Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit | 10923ES20/50 | 20 T/50 T |
TOPO克隆-兼容TA/平末端 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES20 | 20 T |
高保真PCR | 2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) | 10164ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
5 min快速完成感受態(tài)轉(zhuǎn)化 | F DH5α化學(xué)感受態(tài) | 11803ES80 | 10×100 μL |
