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柱式法質(zhì)粒提取的原理
柱式法質(zhì)粒提取主要基于SDS-堿裂解法。細(xì)胞在高pH的強(qiáng)陰離子洗滌劑SDS作用下，細(xì)胞壁被裂解，染色體DNA和蛋白質(zhì)發(fā)生變性并相互纏繞形成大型復(fù)合物,。這些復(fù)合物在鉀離子取代鈉離子時從溶液中沉淀下來，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中,。由于DNA帶負(fù)電,，質(zhì)粒提取柱中的硅基質(zhì)膜在高鹽條件下能選擇性地吸附DNA。通過去離子水洗脫,，最終得到純化的質(zhì)粒DNA,。
質(zhì)粒提取的每種試劑關(guān)鍵成分是什么呢？今天我們來大揭秘
組分 | 關(guān)鍵成分和功能 |
緩沖液 RS*（P1） | 關(guān)鍵成分:25mM Tris-HCl(pH8.0),、10mM EDTA,、50mM 葡萄糖 功能:將菌體沉淀懸浮起來,，有助于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。 注:在使用緩沖液 RS*之前,，需要添加 RNase A,，該酶的作用是降解溶液中的 RNA |
裂解液 LB（P2） | 關(guān)鍵成分:250mM NaOH、1%(W/V)SDS(十二烷基硫酸鈉) 功能:細(xì)胞進(jìn)行裂解 |
結(jié)合液 BD（P3） | 關(guān)鍵成分:3M醋酸鉀（potassium acetate）和5M醋酸 功能:中和NaOH,，并清除蛋白質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì) |
漂洗液 W* | 關(guān)鍵成分:10mM Tris-HCl(pH7.5),、80%乙醇(Ethanol) 功能:去除DNA提取過程中產(chǎn)生的多余鹽離子 |
洗脫液 | 關(guān)鍵成分:10mM Tris-HCl（pH7.5）的溶液 功能:幫助DNA從硅膠柱中洗脫出來 |
質(zhì)粒提取之后，如何評估質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量呢,？
目前使用分光光度法定量質(zhì)粒DNA和通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)粒DNA產(chǎn)率和質(zhì)量的分析是兩種常用的方法,。
舉例：提取2 mL過夜培養(yǎng)的大腸桿菌PUC19質(zhì)粒，分光光度法檢測質(zhì)粒的得率,，在15 μg左右,，260/280=1.8~2.0，260/230=2.0~2.3,；瓊脂糖凝膠電泳顯示三條帶,，從上至下依次為：開環(huán)DNA、線性DNA,、超螺旋DNA,，其中超螺旋DNA的占比＞90%。
質(zhì)粒提取常見問題案例梳理
出現(xiàn)嚴(yán)重的RNA污染
如圖所示,，質(zhì)粒提取之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,，出現(xiàn)明顯的RNA條帶，說明有RNA污染,。
原因及解決方法：
（1）未在緩沖液 RS*中事先加入RNase A,。解決方法：補(bǔ)加RNase A。
（2）加入RNase A的緩沖液 RS*長期保存于室溫,，導(dǎo)致RNase A活性下降,。解決方法：每次使用后置于 4℃保存。若長期不用,，置于-20℃保存,。
（3）細(xì)菌過量,RNase A不能有效降解RNA。解決方法：將細(xì)菌用量減半或增加RNase A在緩沖液 RS*中的濃度,。
出現(xiàn)基因組污染
（1）菌體裂解和中和過程中,劇烈混合造成基因組DNA斷裂所致,。解決方法：溫和地進(jìn)行菌體的裂解和中和。
（2）加裂解液 LB時操作時間過長,，造成基因組DNA斷裂所致,。解決方法：將裂解步驟控制在5分鐘內(nèi)完成。
（3）細(xì)菌的質(zhì)量差（反復(fù)凍融的細(xì)菌，陳舊的細(xì)菌,，培養(yǎng)條件不合適的細(xì)菌等）中有許多斷裂或降解而游離的基因組DNA,，使用生長良好的新鮮細(xì)菌。
超螺旋質(zhì)粒比例低
如圖右所示,，質(zhì)粒提取之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,，開環(huán)質(zhì)粒的占比約20%，說明超螺旋比例低,，一般超螺旋比例需要＞90%,，一般來說超螺旋比例越高，質(zhì)粒的穩(wěn)定性越高,，高超螺旋比例的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染效率,、基因表達(dá)水平等方面具有更好的表現(xiàn),。
原因：裂解時間不宜過長,，加入裂解液后裂解時間不應(yīng)超過5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞
解決方法：優(yōu)化裂解時間,；確保質(zhì)粒的結(jié)合和所有溶液都在室溫下進(jìn)行,，減少離心力對質(zhì)粒超螺旋結(jié)構(gòu)的影響，因?yàn)檫^度的離心可能會破壞質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu),。
內(nèi)毒素殘留高
常規(guī)質(zhì)粒DNA純化中,，質(zhì)粒DNA仍需要從55%蛋白質(zhì)、20%RNA,、3%內(nèi)毒素和3%基因組DNA中分離,，在質(zhì)粒DNA制備的菌體裂解過程中，內(nèi)毒素分子被釋放到溶菌液中,。由于內(nèi)毒素常形成囊狀結(jié)構(gòu),，其分子量、電荷性和疏水性都與質(zhì)粒DNA相似,，常用的純化方法很難將內(nèi)毒素與質(zhì)粒DNA分開,。內(nèi)毒素會降低原代細(xì)胞和敏感培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，干擾免疫細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染,。由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，對質(zhì)粒DNA的內(nèi)毒素要求亦不同，尤其是在細(xì)胞轉(zhuǎn)染,、基因沉默研究,、基因治療等過程中，對質(zhì)粒質(zhì)量,、內(nèi)毒素水平要求更為苛刻,，對于非敏感型的的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，要求內(nèi)毒素殘留0.1～2.5 EU/ug，對于敏感型的的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),，要求內(nèi)毒素殘留＜0.1 EU/ug,。
原因：內(nèi)毒素去除時操作不當(dāng)或者未選擇合適的試劑
解決方法：
（1）如果采用的內(nèi)毒素清除的方法，離心之后,，上層水相含DNA,，下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì)。這時注意不要吸到藍(lán)色油狀層,，里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì),。
（2）在使用樹脂純化系統(tǒng)去除內(nèi)毒素時，需要先活化樹脂,，然后使用平衡緩沖液平衡樹脂,，以確保最佳的去除效率。
翌圣生物的質(zhì)粒提取試劑盒,，歷經(jīng)市場多年的磨礪與錘煉,，產(chǎn)品成熟而穩(wěn)定。產(chǎn)品品質(zhì),，不僅贏得了廣泛的認(rèn)可與贊譽(yù),，更累積了超過300的影響因子總分?jǐn)?shù)，成為眾多科研工作者,！
產(chǎn)品推薦
柱式法
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
19021ES50/ES70 | MolPure® Endo-free Plasmid Mini Kit 無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒 | 50T/200T |
19001ES50/ES70 | MolPure® Plasmid Mini Kit 質(zhì)粒小量提取試劑盒 | 50T/200T |
19036ES10 | MolPure® Endo-free Plasmid Maxi Kit 無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒 | 10T |
19101ES50/ES70 | MolPure® Gel Extraction Kit 瓊脂糖凝膠回收試劑盒 | 50T/200T |
19106ES50/ES70 | MolPure® PCR Purification Kit PCR產(chǎn)物純化試劑盒 | 50T/200T |
磁珠法
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 備注 |
18538ES50/ES70 | MolPure® Magnetic Plasmid Mini Kit 磁珠法質(zhì)粒小量提取 | 50 T/200 T | 磁珠,，瓶裝 |
18539ES16/48 | MolPure® Mag16/48 Plasmid Mini Kit（Prepackaged） | 16 T/48T | 磁珠16/48預(yù)裝，適配AP-16S和AP-48 |
18541ES96 | MolPure® Mag96 Plasmid Mini Kit （Prepackaged）磁珠法96孔質(zhì)粒小量提取試劑盒（預(yù)封裝） | 96T | 磁珠96預(yù)裝,，適配AP-96N |
18542ES48 | 18542ES MolPure® Magnetic Endo-free Plasmid Mini Kit 磁珠法去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒 | 48 T | 磁珠,，瓶裝 |
18543ES24/ES48 | 18543ES MolPure® Magnetic Plasmid med Kit 磁珠法質(zhì)粒去內(nèi)毒素中量提取試劑盒 | 24T/48 T | 磁珠，瓶裝 |
