日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

病毒是一種由核酸分子和蛋白質(zhì)構(gòu)成的非細(xì)胞形態(tài)生物,，能夠攜帶基因進(jìn)入受體細(xì)胞,，經(jīng)開(kāi)發(fā)和改造后可用作細(xì)胞基因治療(CGT)載體,。通過(guò)改造后的病毒載體一般具有更好的安全性和更快的分子克隆速度,，同時(shí)感染能力也得到了定向進(jìn)化，從而具備了更快捷,、更廣譜的轉(zhuǎn)導(dǎo)特性,，以及更安全、更特異的感染特性,。然而由于病毒的多樣性及宿主機(jī)體的高度復(fù)雜性,，目前僅腺病毒、腺相關(guān)病毒,、慢病毒,、逆轉(zhuǎn)錄病毒和溶瘤病毒等少數(shù)種類(lèi)可改造為CGT載體。

其中,，逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）又稱(chēng)反轉(zhuǎn)錄病毒,，是一種RNA病毒，病毒顆粒為二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu),、球形,，有包膜，表面有刺突,。逆轉(zhuǎn)錄病毒需在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,，將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，新合成的cDNA插入宿主的核DNA中,，隨宿主DNA復(fù)制,、轉(zhuǎn)錄、翻譯達(dá)到擴(kuò)增目的,。

按照目前國(guó)際病毒分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),，逆轉(zhuǎn)錄病毒科分為7個(gè)屬：α逆轉(zhuǎn)錄病毒屬,、β逆轉(zhuǎn)錄病毒屬、γ反轉(zhuǎn)錄病毒屬,、δ反轉(zhuǎn)錄病毒屬,、ε反轉(zhuǎn)錄病毒屬、慢病毒屬和泡沫病毒屬,。在這些逆轉(zhuǎn)錄病毒中,，僅γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒用于臨床。

因此,，通常所說(shuō)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是指在γ逆轉(zhuǎn)錄病毒（GRV）的基礎(chǔ)上改造獲得的,，主要包括MMLV（莫洛尼氏鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒）和MSCV（鼠干細(xì)胞病毒）。這些載體能夠?qū)⑼庠椿蛴行У卣系剿拗骷?xì)胞的基因組中,，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因表達(dá),。

γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有簡(jiǎn)單的基因組結(jié)構(gòu)，由以下蛋白質(zhì)編碼基因組成：gag,、pol和env,。Gag編碼衣殼蛋白，Pol編碼病毒酶(逆轉(zhuǎn)錄酶,、整合酶和蛋白酶),，Env編碼囊膜蛋白。

圖1. 基于小鼠白血病病毒(MLV)的γ逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的結(jié)構(gòu)(doi：10.3390/v3060677)

γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝系統(tǒng)通常包括三個(gè)關(guān)鍵的質(zhì)粒：包裝質(zhì)粒（含有γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag,、pol和rev基因）,、載體質(zhì)粒（包含目的基因、選擇標(biāo)記基因以及必要的病毒序列）和包膜質(zhì)粒（含病毒粒子的表面蛋白,，如env基因）,。

γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的生產(chǎn)平臺(tái)主要有兩種：一種是瞬時(shí)工藝，采用上述三質(zhì)粒系統(tǒng),，共轉(zhuǎn)染到HEK293T包裝細(xì)胞系中,，進(jìn)行病毒制備；另外一種是穩(wěn)定工藝,，即以表達(dá)包裝和囊膜基因的包裝細(xì)胞系制備穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞株（如PG13）,。

通常，通過(guò)改造將逆轉(zhuǎn)錄病毒中與病毒包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因刪除,，替換為需要表達(dá)的外源基因,，因此生產(chǎn)的病毒顆粒是復(fù)制缺陷型的，無(wú)法在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并組裝為新的病毒顆粒,，但能將外源基因整合到宿主基因組中持續(xù)表達(dá),。

目前制備CAR-T細(xì)胞所用的慢病毒和γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體均為復(fù)制缺陷型，已極大降低了產(chǎn)生復(fù)制型病毒的風(fēng)險(xiǎn)，但病毒載體的制備方法以及制備過(guò)程中仍存在產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒或復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒的潛在風(fēng)險(xiǎn),。這些風(fēng)險(xiǎn)主要源自：病毒載體生產(chǎn)過(guò)程中,，因穿梭質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒及包裝細(xì)胞(eg.HEK293/HEK293T)中的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄元件之間發(fā)生的同源或非同源重組,；慢病毒載體與T細(xì)胞的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄元件之間發(fā)生的同源或非同源重組,。

因此，復(fù)制型病毒（RCV）可能在病毒載體生產(chǎn)階段,、CAR-T細(xì)胞制備階段,，甚至在患者接受治療后，隨著CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持續(xù)擴(kuò)增,，依然存在產(chǎn)生RCL/RCR的潛在風(fēng)險(xiǎn)。終產(chǎn)品中復(fù)制型病毒的存在有可能引起病人不良反應(yīng),，構(gòu)成臨床隱患和潛在危險(xiǎn),，故對(duì)復(fù)制型病毒檢測(cè)是安全性檢測(cè)中非常重要的項(xiàng)目。

隨著病毒載體在CGT領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣泛,，相關(guān)法規(guī)和技術(shù)原則對(duì)監(jiān)測(cè)復(fù)制型病毒提出了建議,。

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心(CDE)在2020年9月發(fā)布《基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見(jiàn)稿）》：采用復(fù)制缺陷型或條件復(fù)制型病毒載體時(shí)，應(yīng)在生產(chǎn)工藝的適當(dāng)階段檢測(cè)生產(chǎn)過(guò)程中可能產(chǎn)生的具有復(fù)制能力的病毒,、親本病毒或野生型病毒進(jìn)行檢測(cè),，并根據(jù)給藥劑量等確定殘留量的標(biāo)準(zhǔn)限度。常見(jiàn)的復(fù)制型病毒檢測(cè)方法包括指示細(xì)胞培養(yǎng)法,、直接qPCR法等,。可復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒（RCR）檢測(cè)：建議采用敏感的指示細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行RCR檢測(cè),。RCR擴(kuò)增細(xì)胞與待測(cè)樣本進(jìn)行共培養(yǎng)以大程度擴(kuò)增RCR,，在一定傳代次數(shù)和時(shí)間的傳代培養(yǎng)后取適量上清接種RCR指示細(xì)胞培養(yǎng)，以觀察,、計(jì)數(shù)細(xì)胞病變集落或者進(jìn)行RCR標(biāo)志物的檢測(cè),。

2022年5月，CDE發(fā)布的《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中提到RCR：

美國(guó)FDA 2020年發(fā)布的關(guān)于RCR/RCL檢測(cè)指南提出：對(duì)于RCR/RCL的檢測(cè)包含指示細(xì)胞培養(yǎng)法,、ELISA法(p24蛋白測(cè)定),、PCR/Q-PCR法（通過(guò)psi-gag或VSV-G聚合酶鏈反應(yīng)）、PERT法（產(chǎn)物增強(qiáng)性逆轉(zhuǎn)錄檢測(cè)法）共4種檢測(cè)方法,。

中美歐三國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)于復(fù)制型病毒的控制階段和檢測(cè)要求基本相同,，在產(chǎn)品生產(chǎn)的各個(gè)階段以及在接受基于病毒載體的基因治療的患者后續(xù)監(jiān)測(cè)中進(jìn)行檢測(cè)。并且各監(jiān)管機(jī)構(gòu)推薦的復(fù)制型病毒的檢測(cè)方法均是指示細(xì)胞培養(yǎng)法,，該方法是復(fù)制型病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),。

但考慮到CAR-T細(xì)胞終產(chǎn)品一般需要新鮮輸注的特殊情況，基于細(xì)胞培養(yǎng)法的RCL/RCR檢測(cè)方法周期較長(zhǎng)，建議在細(xì)胞產(chǎn)品制備過(guò)程中進(jìn)行全面控制(如對(duì)慢病毒載體及生產(chǎn)終末細(xì)胞采用基于細(xì)胞培養(yǎng)方法測(cè)定RCL/RCR,，以確保生產(chǎn)工藝過(guò)程中不存在RCL/RCR的風(fēng)險(xiǎn)),，細(xì)胞終產(chǎn)品階段可采用qPCR快檢法快速放行。

針對(duì)上述情況,，翌圣生物自主研發(fā)了復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒RCR檢測(cè)試劑盒,，采用熒光探針RT-PCR法特異性擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上包含env在內(nèi)的序列，專(zhuān)一快速的檢測(cè)各種使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相關(guān)的細(xì)胞產(chǎn)品中可能發(fā)生的復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒的潛在風(fēng)險(xiǎn),。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒,，以及配套的自動(dòng)化核酸提取儀器。