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2023年11月16日，Vertex Pharmaceuticals和CRISPR Therapeutics共同宣布基因編輯療法產(chǎn)品CASGEVY™（Exagaglogene autotemcel）獲英國藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)MHRA有條件批準(zhǔn)上市,，用于治療治療鐮狀細(xì)胞?。⊿CD）和輸血依賴性β-地中海貧血（TDT）,，是獲批上市的CRISPR基因編輯藥物,，12月8日，美國食品和藥物管理局（FDA）也批準(zhǔn)了該基因編輯治療藥物,。這是基因編輯治療里程碑事件,，代表著一項(xiàng)重大的科學(xué)進(jìn)步可以讓數(shù)以萬計(jì)的患者受益。
圖1. CASGEVY™治療流程（Source：CRISPR Therapeutics）
CRISPR基因編輯療法
自2012年亮相以來,，CRISPR技術(shù)已在基因功能研究,、藥物靶點(diǎn)篩選、遺傳疾病治療,、癌癥研究以及作物育種等多個(gè)領(lǐng)域取得突破性成果,。其工作機(jī)制如下：
Cas蛋白（如常用的Cas9）在gRNA的引導(dǎo)下定位到目標(biāo)DNA序列，隨后Cas9與DNA結(jié)合并切割其雙鏈,，產(chǎn)生一個(gè)雙鏈斷裂（DSB）,。細(xì)胞為了修復(fù)這一斷裂，將啟動(dòng)自身的修復(fù)機(jī)制,，如非同源末端連接（NHEJ）或同源重組修復(fù)（HDR）,。通過這些修復(fù)過程，可以在目標(biāo)DNA中引入特定的序列,。
目前CRISPR技術(shù)能精確度對(duì)DNA進(jìn)行修改,，包括添加、刪除或替換特定基因片段,，這一進(jìn)步不僅使基因修復(fù)更加便捷和精準(zhǔn)，也為基因治療指明了新的發(fā)展方向,?；贑RISPR技術(shù)的基因治療主要分為體外和體內(nèi)兩種形式，下面將為大家詳細(xì)介紹,。
圖2. 體外與體內(nèi)基因編輯療法[1]
體外基因編輯療法
體外CRISPR基因編輯療法主要包括從患者身上收集細(xì)胞,、在體外進(jìn)行進(jìn)行CRISPR基因編輯、將編輯后的細(xì)胞移植回患者體內(nèi)等流程,，上述介紹的CASGEVY™便是典型的體外CRISPR基因編輯療法,。除了直接利用CRISPR技術(shù)糾正導(dǎo)致癌癥的基因突變外，該技術(shù)在癌癥治療領(lǐng)域的另一關(guān)鍵應(yīng)用是免疫細(xì)胞的工程化改造,，如創(chuàng)建嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）,、通用型CAR-T（UCAR-T）等抗癌免疫療法。
CAR-T療法是通過改造患者自體T細(xì)胞,，使T細(xì)胞表面表達(dá)針對(duì)特定癌癥抗原的嵌合抗原受體（CAR）,，通過CAR特異性識(shí)別體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，并釋放大量的多種效應(yīng)因子,，高效地殺滅腫瘤細(xì)胞,。然而,，CAR-T療法在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，包括較長的制備周期,、自體T細(xì)胞質(zhì)量的不穩(wěn)定性以及相對(duì)較高的治療成本,，這些因素限制了其更廣泛的應(yīng)用。
圖3. CAR-T療法流程圖[2]
為了突破傳統(tǒng)CAR-T療法的限制,，UCAR-T療法,，即通用型CAR-T或異體CAR-T應(yīng)運(yùn)而生。這種療法使用健康捐獻(xiàn)者的T細(xì)胞作為原料,，通過病毒載體等技術(shù)將CAR基因?qū)隩細(xì)胞,，并運(yùn)用基因編輯技術(shù)去除T細(xì)胞表面的TCR、HLA或CD52等分子,，以預(yù)防供體T細(xì)胞引發(fā)的移植物抗宿主?。℅vHD）并降低患者對(duì)異體細(xì)胞的排異反應(yīng)（HvGR）。經(jīng)過這一系列精細(xì)的改造和擴(kuò)增過程,，UCAR-T細(xì)胞被制備成可用于治療患者的成熟產(chǎn)品,。
圖4. UCAR-T療法流程[3]
UCAR-T療法流程：
供者篩選
選擇健康供者進(jìn)行T細(xì)胞的采集。
CAR的引入
利用病毒載體或非病毒方法將CAR基因轉(zhuǎn)入T細(xì)胞,，使其能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的抗原,。
基因編輯
使用CRISPR/Cas、TALENs或ZFNs等基因編輯技術(shù),，敲除T細(xì)胞表面的TCR,、HLA或其他可能導(dǎo)致免疫排斥的分子，以降低異體反應(yīng),。
體外擴(kuò)增
在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)改造后的T細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增,，以獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量用于治療。
質(zhì)量控制
對(duì)擴(kuò)增后的UCAR-T細(xì)胞進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè),，包括細(xì)胞活性,、純度、無菌性等,。
患者篩選和準(zhǔn)備
確定患者是否適合接受UCAR-T治療,，并進(jìn)行一些預(yù)處理，以減少宿主對(duì)UCAR-T的排斥,。
細(xì)胞輸注
將UCAR-T細(xì)胞通過靜脈輸注到患者體內(nèi),。
CRISPR基因編輯的體外療法涉及從患者體內(nèi)提取細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中進(jìn)行基因修改,，然后將經(jīng)過編輯的細(xì)胞重新輸回患者等過程,。這種方法適用于某些關(guān)鍵類型的細(xì)胞，如造血干細(xì)胞（HSC）,，但并不適用于所有種類的細(xì)胞,。另一種基因編輯療法是直接在體內(nèi)進(jìn)行的基因編輯,，無需細(xì)胞提取和體外操作的步驟，可直接在患者的體內(nèi)進(jìn)行基因編輯,。這種方法易于批量生產(chǎn),，給藥方式簡單，能顯著降低治療成本,，還能為難以進(jìn)行細(xì)胞提取或體外培養(yǎng)的疾病提供治療可能,。
體內(nèi)CRISPR基因編輯療法
體內(nèi)基因編輯療法主要通過將基因編輯工具直接輸送至患者體內(nèi)，在體內(nèi)環(huán)境中對(duì)引發(fā)疾病的特定基因進(jìn)行精確且有效的修改,。目前已用于體內(nèi)基因編輯治療的基因編輯工具有3類：核酸酶（Nucleases）,、堿基編輯器（Base editors）及先導(dǎo)編輯器（Prime editors）。
圖5. 體內(nèi)基因編輯療法原理圖[4]
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,，通常利用核酸酶在基因組DNA的特定位置引入DSB實(shí)現(xiàn)有效的基因編輯,，其中，CRISPR-Cas核酸酶系統(tǒng)因其高效性和精確性而成為創(chuàng)建定向DSB廣泛的應(yīng)用工具,。CRISPR-Cas核酸酶系統(tǒng)體內(nèi)基因編輯流程如下：
gRNA設(shè)計(jì)及合成
設(shè)計(jì)特異性的導(dǎo)向RNA（gRNA）以靶向特定的DNA序列,。
Cas蛋白遞送形式選擇
選擇合適的基因編輯形式，如質(zhì)粒DNA（pDNA）,、mRNA或Cas核糖核蛋白（RNP）,。
遞送系統(tǒng)的選擇與優(yōu)化
選擇合適的遞送系統(tǒng)，如腺相關(guān)病毒（AAV）,、脂質(zhì)納米顆粒（LNP）,、病毒樣顆粒（VLP）等。
體內(nèi)送達(dá)
將基因編輯復(fù)合體通過靜脈注射,、局部注射或其他方式遞送到患者體內(nèi),。
基因編輯
在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)，gRNA引導(dǎo)Cas蛋白識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)DNA序列,。Cas蛋白在目標(biāo)位點(diǎn)造成DNA雙鏈斷裂（DSB）。
DNA修復(fù)
細(xì)胞通過自身的DNA修復(fù)機(jī)制,，對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù),。
監(jiān)測(cè)與評(píng)估
監(jiān)測(cè)基因編輯效果，評(píng)估脫靶效應(yīng)和治療效果,。通過生物標(biāo)志物和臨床指標(biāo)評(píng)估安全性和有效性,。
圖6. 核酸酶作用原理圖[1]
來源于化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的SpCas9蛋白是目前最為常用的一種Cas蛋白，然而,，由于SpCas9潛在的脫靶效應(yīng)和尺寸限制等問題,，研究人員持續(xù)探索其他類型的Cas蛋白，如Cas12和Cas13,，以期找到更小,、更精確的Cas蛋白,。同時(shí)，通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)Cas蛋白進(jìn)行改造也是當(dāng)前研究的重點(diǎn)之一,。這些改造旨在提高基因編輯的效率,、減少脫靶率并優(yōu)化編輯窗口，從而進(jìn)一步擴(kuò)展CRISPR技術(shù)在基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力,。
目前CRISPR基因編輯技術(shù)仍處于高速發(fā)展階段,，整個(gè)行業(yè)尚未成熟，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步,，預(yù)計(jì)會(huì)有更多的遞送技術(shù)得到改進(jìn),，新的傳遞工具也將誕生，從而進(jìn)一步提高治療的安全性和效果,。體外CRISPR基因編輯療法已上市,，相信體內(nèi)療法也會(huì)在不久的將來問世。
基因編輯相關(guān)產(chǎn)品
編輯類型 | 產(chǎn)品分類 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
體外編輯（研究級(jí)） | Cas9蛋白 | Cas9 Nuclease | 14701ES |
Cas12a蛋白 | ArCas12a Nuclease | 14702ES | |
Cas12b蛋白 | AapCas12b Nuclease | 14808ES | |
sgRNA合成 | Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit | 11355ES | |
表達(dá)鑒定 | Cas9(CRISPR Associated Protein 9) ELISA Kit | 99401ES | |
體內(nèi)編輯 （GMP級(jí)） | 內(nèi)切酶 | BspQI GMP-grade (10 U/μL) | 10664ES |
Bsa I GMP-grade (20 U/μL) | 10661ES | ||
T7 RNA Polymerase | T7 RNA Polymerase GMP-grade (50 U/μL) | 10624ES | |
無機(jī)焦磷酸酶 | Pyrophosphatase,Inorganic GMP-grade | 10620ES | |
RNase抑制劑 | Murine RNase inhibitor GMP-grade | 10621ES | |
牛痘病毒加帽酶 | mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade | 10614ES | |
Cap2氧甲基轉(zhuǎn)移酶 | mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase GMP-grade | 10612ES |
參考文獻(xiàn)：
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