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單細(xì)胞技術(shù)哪家強(qiáng),，翌圣生物來幫忙,。
單細(xì)胞技術(shù)介紹
單細(xì)胞測(cè)序技術(shù),，簡(jiǎn)單來說,，就是在單個(gè)細(xì)胞水平上，對(duì)基因組,、轉(zhuǎn)錄組及表觀基因組水平進(jìn)行測(cè)序分析的技術(shù),。傳統(tǒng)的測(cè)序，是在多細(xì)胞基礎(chǔ)上進(jìn)行的,，實(shí)際上得到的是一堆細(xì)胞中信號(hào)的均值,，丟失了細(xì)胞異質(zhì)性（細(xì)胞之間的差異）的信息。而單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠檢出混雜樣品測(cè)序所無法得到的異質(zhì)性信息,，從而很好的解決了這一問題,。
單細(xì)胞技術(shù)類型
單細(xì)胞技術(shù)類型很多，有單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組,、單細(xì)胞基因組,、單細(xì)胞表觀組（單細(xì)胞ATAC、單細(xì)胞CUT&Tag,、單細(xì)胞甲基化,、單細(xì)胞Hi-C等）、單細(xì)胞蛋白組,、單細(xì)胞代謝組等,，各種技術(shù)不斷迭代，檢測(cè)靈敏度也不斷提升,。
在眾多細(xì)胞技術(shù)中,，應(yīng)用廣泛的當(dāng)屬單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組了。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組也分為低通量的smart-seq1/2/3和高通量的微流控和微孔板等研究,。
今天我們要介紹的主角是Smart-seq2
單細(xì)胞技術(shù)類型
Smart-seq技術(shù)于2012年由Ramsk?ld團(tuán)隊(duì)發(fā)表,；
Smart-Seq2技術(shù)于2013年及2014年由Picelli團(tuán)隊(duì)改進(jìn)并發(fā)表；
Smart-seq3技術(shù)則于2020年由瑞典卡羅林斯卡學(xué)院的Rickard團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步改進(jìn)并發(fā)表,。
雖然Smart-seq技術(shù)也迭代了多個(gè)版本,，但是迄今為止，Smart-Seq2是使用最多且被廣泛認(rèn)為更穩(wěn)定的技術(shù)類型,，也是國內(nèi)市場(chǎng)眾多科技服務(wù)公司推崇的技術(shù)之一,。
Smart-seq2技術(shù)原理
Smart-seq2關(guān)鍵技術(shù)原理有：
MMLVRT
使用的MMLV具有鏈置換活性和末端轉(zhuǎn)移酶活性。其在逆轉(zhuǎn)錄到達(dá)mRNA 5’端末端時(shí),，會(huì)在新合成的cDNA的3’末端多出幾個(gè)C堿基,；
TSO引物序列
TSO引物的5’端含有1個(gè)通用引物序列，而在其3’端,，有兩個(gè)核糖鳥苷（rG）和一個(gè)鎖核苷酸（LNA）修飾的鳥苷（G）,，可以促進(jìn)模板轉(zhuǎn)換，進(jìn)而擴(kuò)增出完整的cDNA序列,；
某些物種RNA中有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、環(huán)形結(jié)構(gòu)等二級(jí)結(jié)構(gòu)容易形成空間位阻影響逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合,，添加甜菜堿和海藻糖能在一定程度上增加酶的熱穩(wěn)定性,，同時(shí)破壞RNA的空間位阻。同時(shí),，甜菜堿和Mg2+同時(shí)存在,，能在一定程度上提高cDNA產(chǎn)量。
Smart-seq2技術(shù)流程
Smart-seq2單細(xì)胞分離方法
單細(xì)胞分離方法很多,，有梯度稀釋法,、口吸管移液法、自動(dòng)顯微操作法,、顯微切割法,、流式分選法等，不同的方法對(duì)比如下：
方法 | 描述 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
梯度稀釋法 | 梯度稀釋細(xì)胞懸液至每孔一個(gè)細(xì)胞 | 方法簡(jiǎn)單,，無需專業(yè)設(shè)備 | 耗時(shí),，分離得到的細(xì)胞可能是多個(gè)細(xì)胞 |
口吸管移液法 | 使用玻璃毛細(xì)管分離單細(xì)胞 | 方法簡(jiǎn)單 | 操作困難，具有隨機(jī)行 |
自動(dòng)顯微操作法 | 使用自動(dòng)微量移液管分離單細(xì)胞 | 可在位置放置細(xì)胞 | 需要專業(yè)設(shè)備 |
激光顯微切割 | 使用激光從組織切片中分離單細(xì)胞 | 保留了空間關(guān)系 | 技術(shù)上有難度,，有潛在UV損傷 |
FACS | 使用電荷分離含有單細(xì)胞的微滴 | 根據(jù)細(xì)胞大小,、形態(tài)、內(nèi)部復(fù)雜性和蛋白表達(dá)（通過抗體標(biāo)記）準(zhǔn)確篩選細(xì)胞類型 | 需要昂貴的專業(yè)設(shè)備,，細(xì)胞處于高壓條件下 |
Smart-seq2技術(shù)與其他單細(xì)胞技術(shù)對(duì)比
單細(xì)胞技術(shù)除了Smart-seq,、Smart-seq2和Smart-seq3之外，還有CEL-seq2/C1,、Drop-seq,、MARS-seq、SCRBseq,。文章Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Mol Cell. 2017;65(4):631-643.e4. doi:10.1016/j.molcel.2017.01.023從不同角度來對(duì)單細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行評(píng)估,，綜合來看,，Smart-seq2更勝。
測(cè)序質(zhì)量對(duì)比
圖.不同單細(xì)胞技術(shù)的測(cè)序質(zhì)量對(duì)比
六種測(cè)序方法都有比較好的測(cè)序質(zhì)量,，均超過 50% 的數(shù)據(jù)成功被 mapping到,。另外，可以明顯發(fā)現(xiàn)基于全長測(cè)序方案的 Smart-seq 較 UMI,，外顯子區(qū)域的 reads 更多,，其中 smart-seq2 有 48% 的 reads 比對(duì)到外顯子區(qū)域（如下圖）。這表明 Smart-seq2（48% reads 比對(duì)到外顯子）和 Smart-seq（30% reads 比對(duì)到外顯子）較 UMI 方案（均低于 15% reads 比對(duì)到外顯子）有更好的測(cè)序質(zhì)量,。
基因檢測(cè)效率對(duì)比
圖.不同單細(xì)胞技術(shù)測(cè)序深度和基因檢出數(shù)對(duì)比
采用抽樣的飽和度分析對(duì)測(cè)序深度進(jìn)行評(píng)估,，當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到 100 萬reads時(shí)，這六種測(cè)序方法均可達(dá)到飽和,，但明顯 Smart-seq2 具有更好的基因檢測(cè)效率,。
單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)的敏感度對(duì)比
圖.不同單細(xì)胞技術(shù)基因檢出情況對(duì)比
在相同的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞建庫，相同的測(cè)序深度下,，檢測(cè)單細(xì)胞中基因表達(dá)數(shù)量,。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smart-seq2 敏感度最好,，達(dá)到中位數(shù) 9138/cell,，而低的是 Drop-seq 和 MARS-seq，分別約為 4811/cell 和 4763/cell,。
多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)的敏感度對(duì)比
圖.不同數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行微量細(xì)胞建庫時(shí)基因檢出情況對(duì)比
多個(gè)細(xì)胞建庫后的reads合在一起進(jìn)行生信分析,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smart-seq2 仍然具有更多的基因被檢測(cè)到,，MARS-seq 仍然具有最少的基因被檢測(cè)到,，這與單細(xì)胞敏感度檢測(cè)是一致的。
單細(xì)胞建庫結(jié)果重復(fù)性對(duì)比
圖.不同單細(xì)胞技術(shù)建庫后的相關(guān)性分析
利用 92 個(gè)已知的外源 ERCC 轉(zhuǎn)錄本,，進(jìn)一步采用線性模型擬合了觀測(cè)的表達(dá)值與已知濃度的相關(guān)系數(shù)（R2）,。通過分析發(fā)現(xiàn)，這六種方法的相關(guān)系數(shù)都較高,，都高于 0.80 的相關(guān)系數(shù),。這表明這六種方法的準(zhǔn)確度都較好，但 Smart-seq2 的相關(guān)系數(shù)為 0.91,，而 MARS-seq 相關(guān)系數(shù)為 0.83,。
不同單細(xì)胞技術(shù)的Drop out對(duì)比
圖.不同單細(xì)胞技術(shù)Drop out結(jié)果對(duì)比
對(duì)至少 65 個(gè)單細(xì)胞分析中發(fā)現(xiàn)，13361 個(gè)基因在 25% 的細(xì)胞中至少被一種方法檢測(cè)到表達(dá),，那么挑選這些基因進(jìn)行分析,，MARS-seq 具有最高的 drop out 中位概率（74%），而 Smart-seq2 （26%）,，此時(shí)說明 Smart-seq2 具有更好的敏感度,，這與之前的敏感度也是對(duì)應(yīng)的,。
看了以上結(jié)果，是不是對(duì)Smart-seq2技術(shù)更心動(dòng)了呢,，如果你有需求,，聯(lián)系翌圣獲取詳情吧！
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