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在上期的“基因編輯探秘系列之原理篇"中，小翌已經(jīng)詳細介紹了CRISPR系統(tǒng)的分類,、機制和原理。本篇文章將為大家介紹CRISPR技術(shù)的生物形式和遞送技術(shù),。
CRISPR技術(shù)的生物形式
為了實現(xiàn)基因組編輯,，CRISPR/Cas系統(tǒng)的組件需要進入靶細胞的細胞核中發(fā)揮作用，可以通過遞送不同形式的Cas和向?qū)NA（gRNA）來實現(xiàn),，包括質(zhì)粒DNA（pDNA）,，mRNA或Cas核糖核蛋白（RNP）三種生物形式。
pDNA形式
pDNA通常被用作非病毒DNA傳遞的載體,，其介導(dǎo)的CRISPR技術(shù)是將Cas9蛋白和gRNA的基因序列融入單個或多個pDNA載體之中,。因pDNA具有易構(gòu)建、操作簡便以及成本效益高等優(yōu)點,，成為了備受矚目的基因編輯方法,。目前廣泛應(yīng)用的Cas9質(zhì)粒包含兩個表達盒,，一個是密碼子優(yōu)化的Cas9，一個是嵌合的gRNA,。與我們細胞內(nèi)遺傳信息的流動一致,，含有CRISPR系統(tǒng)元件的pDNA需先進入細胞核，隨后轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA,，最后被轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中以啟動后續(xù)的蛋白質(zhì)合成過程,。
mRNA形式
mRNA介導(dǎo)的CRISPR基因編輯技術(shù)，其核心在于將Cas9 mRNA與gRNA共同精準(zhǔn)地遞送至靶細胞,。相較于傳統(tǒng)的pDNA轉(zhuǎn)染方式,，mRNA的遞送方式能夠更為迅速地啟動蛋白質(zhì)表達過程。與pDNA的應(yīng)用策略不同,，基于mRNA的編輯策略要求同時遞送Cas9 mRNA和gRNA這兩種關(guān)鍵的組分,。Cas9 mRNA的制備主要依賴于體外轉(zhuǎn)錄（IVT）技術(shù)，并經(jīng)過加帽和加尾修飾,，以確保其穩(wěn)定性和翻譯效率,。gRNA作為另一重要組件，存在雙鏈和單鏈兩種形式,。雙鏈形式的gRNA由crRNA和tracrRNA共同構(gòu)成,，這兩部分需要通過退火過程形成穩(wěn)定的復(fù)合物。在實際應(yīng)用中,，可以通過化學(xué)合成的方式分別制備crRNA和tracrRNA,，進而組裝成完整的雙鏈gRNA。而單鏈形式的gRNA則是將crRNA和tracrRNA巧妙地融合成一個單一的分子,，無需退火過程,。單鏈gRNA可以通IVT或化學(xué)合成的方式獲得，兩種方法各有利弊,，可根據(jù)實驗需求進行靈活選擇,。
IVT作為一種廣泛應(yīng)用的gRNA生產(chǎn)方法，因其成本效益高,、產(chǎn)量大以及操作簡便等優(yōu)點,，在實驗室中得到了廣泛的推廣和應(yīng)用?；瘜W(xué)合成gRNA是利用高通量化學(xué)合成平臺來完成的,，通過在gRNA的5’和3’端各加入3個硫代和甲氧基修飾，不僅可以提高gRNA的穩(wěn)定性,，還能有效降低脫靶效應(yīng),，從而提高基因編輯的精確性和安全性。
RNP形式
在CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用中，直接遞送Cas9蛋白與gRNA,，從而繞過pDNA或mRNA在細胞內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄與翻譯過程,，無疑是實現(xiàn)高效基因編輯的優(yōu)選方法,。這種基于蛋白的遞送方式同樣依賴于兩個核心成分：Cas9核酸酶與gRNA,，首先將Cas9蛋白與gRNA結(jié)合，形成帶有負電荷的Cas9/gRNA核糖核蛋白（Cas9 RNP）復(fù)合物,，隨后將Cas9 RNP作為單一組分進行遞送,。這種技術(shù)不僅簡化了操作過程,，更提高了基因編輯的效率和準(zhǔn)確性。
圖1. CRISPR-Cas9的三種生物形式[1]
三種生物形式的差異
每種CRISPR系統(tǒng)的生物形式都有的物理,、化學(xué),、生理特性。
穩(wěn)定性
Cas9 pDNA表現(xiàn)出最高的穩(wěn)定性,，相比之下,，mRNA的穩(wěn)定性較差，可通過對其核苷酸進行化學(xué)修飾提升mRNA的穩(wěn)定性,。Cas9 RNP由蛋白質(zhì)和gRNA組成,，其結(jié)構(gòu)使得它容易受到蛋白酶和RNases的降解，因此是最不穩(wěn)定的形式,。
遞送方式
當(dāng)Cas9的pDNA進入細胞后,，它需經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程，最終產(chǎn)生Cas9蛋白,。而Cas9的mRNA則更為直接,，僅需被傳遞至細胞質(zhì)中，便可啟動翻譯過程生成Cas9蛋白,。隨后Cas9蛋白與gRNA組裝為復(fù)合體發(fā)揮編輯作用,。相較之下，RNP形式能夠直接入核進行編輯,，無需經(jīng)歷上述復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。因此,，遞送Cas9 RNP成為了細胞基因組編輯中最為直接且高效的策略,，通常也被認為是最為理想的編輯方法。
脫靶風(fēng)險
在基因組編輯應(yīng)用中,，CRISPR/Cas復(fù)合物僅在基因組修飾發(fā)生期間暫時需要,，其在細胞中過度存在會增加脫靶事件的風(fēng)險。Cas9 RNP和mRNA在細胞內(nèi)的存在時間相對較短,，有助于降低脫靶效應(yīng)的潛在風(fēng)險,。而Cas9 pDNA能夠介導(dǎo)更長時間的基因表達，可能會增加脫靶編輯事件發(fā)生的風(fēng)險。
Cas蛋白尺寸
由于常用的Cas9, Cas12a和Cas13a大小接近4kb, 而用于遞送基因編輯器到體內(nèi)的AAV系統(tǒng)的包裝上限約為4.7 kb,，因此尋找更小的基因編輯系統(tǒng)對于其高效體內(nèi)遞送具有重要意義,。目前不同的Cas系統(tǒng)均有小型Cas蛋白被開發(fā)，如Cas9系統(tǒng)中來自金黃色釀膿葡萄球菌中的SaCas9（1000多個氨基酸）,；Cas12系統(tǒng)中的AaCas12b和BhCas12b（1100多個氨基酸）,；Cas14(又稱Cas12f1，500個氨基酸) ,、Cas12j（又稱CasΦ,，700氨基酸）；Cas13系統(tǒng)中的Cas13bt（~800氨基酸）,，基因編輯已進入迷你時代,。
CRISPR/Cas系統(tǒng)常見的三種應(yīng)用模式pDNA、mRNA和RNP各有優(yōu)缺點,。從張鋒,、劉如謙的最新發(fā)文來看，未來RNP形式的蛋白遞送或?qū)⒊蔀槔^mRNA之后的下一個焦點,。
表1.CRISPRs生物形式對比
CRISPR系統(tǒng)的三種遞送技術(shù)
CRISPR系統(tǒng)的生物形式各異,，因此其遞送方法也呈現(xiàn)出多樣性。目前,，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送策略已發(fā)展出多種方法,，主要分為三大類別：生物遞送方法、化學(xué)遞送方法以及物理遞送方法,。
在生物遞送方法中,，常利用腺相關(guān)病毒（AAV）載體、慢病毒載體等作為傳遞CRISPR/Cas9系統(tǒng)的媒介,，這些載體具有生物相容性好,、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域,。
化學(xué)遞送方法則主要依賴脂質(zhì)納米顆粒（LNP）等納米材料作為載體,，它們能夠高效地封裝CRISPR/Cas9系統(tǒng)并將其遞送至細胞內(nèi)，同時具有較高的靶向性和生物安全性,。
物理遞送方法則包括電穿孔,、顯微注射等技術(shù)，這些方法通過物理手段將CRISPR/Cas9系統(tǒng)直接導(dǎo)入細胞內(nèi)部,，雖然操作復(fù)雜且對細胞損傷較大,，但在某些特定應(yīng)用場景下仍具有的優(yōu)勢。
圖2. CRISPR技術(shù)不同的遞送方式[2]
病毒載體
在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中,，病毒載體扮演著至關(guān)重要的角色,。其中，AAV、慢病毒以及桿狀病毒載體都是常用的遞送工具,。值得一提的是,，AAV已經(jīng)成為體內(nèi)基因治療領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的遞送載體，并成功獲得批準(zhǔn),，遞送CRISPR組件至人體用于疾病治療,。
AAV之所以備受青睞，源于它能夠輕易地跨越物種屏障感染細胞,，同時其免疫原性極低,，大大降低了引發(fā)炎癥反應(yīng)的風(fēng)險。然而,，任何事物都有其局限性,，AAV載體的最大包裝容量僅為4.7kb，這對于體積龐大的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)來說,，無疑是一個巨大的挑戰(zhàn),。尤其是當(dāng)Cas9蛋白攜帶效應(yīng)蛋白時，更是需要采取特殊的修改措施,，如使用體積較小的SaCas9或?qū)⑦f送系統(tǒng)分割為兩個載體,，才能實現(xiàn)在AAV載體中的有效加載。
慢病毒作為能感染分裂和非分裂細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒,，也常用作遞送載體,。由于慢病毒的10kb負載能力，整個CRISPR/Cas9系統(tǒng)都可以加載到其中,，但慢病毒隨機整合入宿主基因組可能引發(fā)免疫反應(yīng),，甚至致癌。
脂質(zhì)納米顆粒（LNP）
盡管病毒載體遞送系統(tǒng)已將CRISPR技術(shù)應(yīng)用于臨床,，但其療效仍受限于多重因素,，如患者免疫反應(yīng)、載荷大小限制,、重復(fù)給藥難度及長期基因表達等問題,。因此，科研人員正積極探索新的遞送策略,，其中LNP-mRNA等非病毒系統(tǒng)備受矚目,。
脂質(zhì)載體是一種很有前景的CRISPR-Cas9系統(tǒng)遞送載體，通常由四種脂類組成：陽離子型（或電離型）脂類,、聚乙二醇脂類、輔助磷脂和膽固醇,。LNP的核心技術(shù)在于其具有pH依賴性的陽離子化脂質(zhì),。在遞送階段，這種脂質(zhì)能夠在中性pH環(huán)境下保持中性狀態(tài)，與周圍的成分和諧共處,。然而,，一旦進入酸性環(huán)境，如細胞內(nèi)的內(nèi)體,，它便會迅速轉(zhuǎn)變?yōu)殛栯x子狀態(tài),。這種電荷狀態(tài)的轉(zhuǎn)變不僅能夠誘導(dǎo)粒子解離，還能夠破壞核內(nèi)體膜,，從而大大增強其從核內(nèi)體逃逸的能力,。這種機制不僅提高了遞送效率，還有效地降低了全身毒性,，使得LNP成為一種安全且高效的遞送工具,。
目前，已有多款基于LNP-RNA的療法成功獲得FDA的批準(zhǔn),，這充分證明了LNP技術(shù)在實際應(yīng)用中的可行性和有效性,。
圖3. LNP組成[2]
新興遞送系統(tǒng)
盡管LNP在臨床實踐中已展現(xiàn)出作為基因編輯納米顆粒遞送系統(tǒng)的先進性，然而,，眾多其他類型的納米載體同樣具備潛力,，可巧妙地設(shè)計以進入細胞內(nèi)部。例如,，聚合物納米顆粒,、蛋白質(zhì)衣殼遞送系統(tǒng)以及類病毒顆粒（VLP）等，均為這一領(lǐng)域的研究者提供了新的遞送策略,。
在本文中,，我們向您介紹了CRISPR/Cas系統(tǒng)的三種生物形式及遞送方法，這些基礎(chǔ)知識鋪墊了對CRISPR技術(shù)的理解,，為我們了解其在廣泛領(lǐng)域應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),。請繼續(xù)關(guān)注我們的系列文章，在接下來的文章中,，我們將帶您了解CRISPR/Cas技術(shù)在細胞基因治療,、農(nóng)業(yè)等不同領(lǐng)域中的應(yīng)用，更多精彩內(nèi)容,，不容錯過,，敬請期待！
Cas RNP相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品分類 | 產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 |
Cas9蛋白 | spCas9含核定位信號 | Cas9 Nuclease | 14701ES |
spCas9+EGFP標(biāo)簽 | NLS-Cas9-EGFP Nuclease | 11364ES | |
dCas9,，無切割活性 | dCas9 Nuclease | 11351ES | |
Cas12a蛋白 | Agathobacter rectalis細菌來源 | ArCas12a Nuclease | 14702ES |
氨基酸球菌來源 | Ascpf1(Cas12) Nuclease | 11352ES | |
新兇手弗朗西斯菌來源 | Fncpf1(Cas12) Nuclease | 11353ES | |
螺科菌來源 | Lbcpf1（Cas12） Nuclease | 11354ES | |
Cas12b蛋白 | 嗜酸耐熱菌來源 | AapCas12b Nuclease | 14808ES |
sgRNA合成 | 體外轉(zhuǎn)錄合成sgRNA | Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit | 11355ES |
參考文獻：
[1] Yi Lin, Ernst Wagner and Ulrich L?chelt, Non-viral delivery of the CRISPR/Cas system: DNA versus RNA versus RNP, Biomater. Sci., 2022, 10, 1166–1192
[2] Taha EA, Lee J, Hotta A. Delivery of CRISPR-Cas tools for in vivo genome editing therapy: Trends and challenges. J Control Release. 2022;342:345-361.
