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在探索生命科學(xué)的奧秘中,，紫杉醇這一神奇的藥物始終占據(jù)著舉足輕重的地位,。作為一種抗擊癌癥的利器,，紫杉醇的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它由一個高度活躍的碳骨架和一條帶有苯基異亮氨酸的側(cè)鏈構(gòu)成,。然而,，正是這種構(gòu)造，使得紫杉醇的合成之路充滿了挑戰(zhàn),。
研究人員對紫杉醇的生物合成路徑進(jìn)行了長達(dá)半個世紀(jì)的研究,，但仍有許多關(guān)鍵的轉(zhuǎn)化步驟隱藏在迷霧之中。特別是,，氧化四環(huán)烷環(huán)的形成和C9位碳原子的氧化過程,，至今仍是一個未解之謎，它們像兩座高峰,，阻擋在我們理解紫杉醇合成路徑的道路上,。
在這條合成路徑中，找到負(fù)責(zé)氧化四環(huán)烷環(huán)和C9位氧化的關(guān)鍵酶,，就像是找到了一把鑰匙,，能夠?qū)⒆仙即忌锖铣傻母鱾€孤立環(huán)節(jié)串聯(lián)起來，形成一條完整的鏈條,。
隨著紫杉醇在癌癥治療中的應(yīng)用越來越廣泛,，市場對它的需求也在不斷攀升。然而,，目前依賴天然資源提取的半合成生產(chǎn)方法,，已經(jīng)無法滿足這種日益增長的需求,。這就像一條狹窄的通道，無法承載日益增多的行人,。
幸運的是,，合成生物學(xué)的興起為我們提供了一條新的道路。通過合成生物學(xué),，我們有望實現(xiàn)紫杉醇的綠色,、可持續(xù)生產(chǎn)。因此,，揭開紫杉醇生物合成路徑的神秘面紗,，不僅能夠滿足市場需求，更能夠推動合成生物學(xué)的發(fā)展,，開啟一個全新的綠色制藥時代,。
2024年1月26日，國際頂級期刊Science(IF:56.9)在線發(fā)表了基因組所閆建斌研究員與北京大學(xué)雷曉光教授等合作完成的最新研究：“Characterization and heterologous reconstitution of Taxus biosynthetic enzymes leading to baccatin III",。該研究不僅揭示了紫杉醇生物合成中的關(guān)鍵酶和步驟,，而且為合成生物學(xué)生產(chǎn)紫杉醇提供了新的策略和方法，有助于減少對天然資源的依賴,，滿足市場對紫杉醇不斷增長的需求,。該研究成果標(biāo)志著我國在紫杉醇合成生物學(xué)理論和技術(shù)方面位于地位。
研究思路
環(huán)氧化催化關(guān)鍵酶-TOT1的解析
在探索紫杉醇這一神奇藥物的背后,，研究人員采取了一系列精妙的實驗步驟,，揭示了TOT1基因在氧化環(huán)形成中的關(guān)鍵角色。首先,，他們運用了一種巧妙的篩選策略,。基于紫杉烷生物合成途徑的知識,，研究人員將CYP725A家族的基因分為三個小組,，并在煙草葉片中同時表達(dá)了這三組基因。隨后,，他們使用液相色譜質(zhì)譜分析技術(shù)來檢測底物的氧化產(chǎn)物,。
接著，他們進(jìn)行了活性篩選,。在表達(dá)了第二組基因的葉片中,，研究人員觀察到了明顯的底物氧化產(chǎn)物峰，這表明該組基因中可能含有他們尋找的酶,。
為了驗證這一假設(shè)，研究人員單獨表達(dá)了第二組中的每一個基因,。他們發(fā)現(xiàn),，當(dāng)Chr9_74725878基因被表達(dá)時,，底物氧化產(chǎn)物的數(shù)量顯著增加。這一發(fā)現(xiàn)證明了該基因編碼的蛋白質(zhì)具有催化氧化環(huán)形成的能力,。
基于這一發(fā)現(xiàn),，該基因被命名為TOT1，并通過體外表達(dá)和底物喂養(yǎng)實驗進(jìn)一步驗證了其功能,。
為了深入了解TOT1的作用機理,，研究人員運用了結(jié)構(gòu)模擬和反應(yīng)機理計算的方法。他們的研究揭示了TOT1介導(dǎo)的氧化環(huán)形成反應(yīng)機理,，即它能直接將烯基轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物和氧化環(huán),。
最后，為了驗證TOT1在紫杉醇生物合成中的關(guān)鍵作用,，研究人員在紫杉植物中敲低了TOT1的表達(dá),。他們觀察到，百菌素和紫杉醇的含量隨之降低,，這一結(jié)果進(jìn)一步證明了TOT1在紫杉醇生物合成中的重要性,。
（圖片來自原文）
紫杉醇氧化烷基環(huán)形成機制
TOT1是一種具有雙重功效的氧化酶。能夠?qū)⒆仙即贾械南┗苯愚D(zhuǎn)化為環(huán)氧化物,，進(jìn)而形成氧化烷基環(huán),。這一過程無需經(jīng)過環(huán)氧化物作為中間體的傳統(tǒng)路徑，而是通過一種更為直接和高效的轉(zhuǎn)化方式,。
在TOT1的催化下,，烯基首先經(jīng)歷氧化反應(yīng)，形成環(huán)氧化物,。然而,，這個環(huán)氧化物并非故事的終點，而是通過一系列結(jié)構(gòu)重排,，最終演變成為氧化烷基環(huán),。這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了人們對氧化烷基環(huán)形成機制的傳統(tǒng)認(rèn)知，為理解紫杉醇的生物合成過程帶來了新的視角,。
（圖片來自原文）
通過精確的計算模擬和深入的結(jié)構(gòu)分析,，研究人員揭示了TOT1催化氧化烷基環(huán)形成的詳細(xì)反應(yīng)機理。他們觀察到了過渡態(tài)和中間體的形成,，這些都是在TOT1催化下發(fā)生的微妙變化,。
（圖片來自原文）
特別值得注意的是，模擬計算結(jié)果顯示,，氧化烷基環(huán)產(chǎn)物的形成在能量上和動力學(xué)上都是優(yōu)先的,，這與實驗結(jié)果不謀而合。這一發(fā)現(xiàn)不僅驗證了計算模型的準(zhǔn)確性,，也為紫杉醇的生物合成提供了新的科學(xué)依據(jù),。
這一機制的創(chuàng)新之處在于,，它打破了我們以往對環(huán)氧化物作為中間體形成氧化烷基環(huán)的認(rèn)知壁壘，為氧化烷基環(huán)的形成提供了全新的解釋,。
C9羥基化酶的突破
研究人員采取了一系列精確的實驗步驟,，最終揭示了關(guān)鍵的C9羥基化酶T9αH1。
首先,，研究人員對不同組織中的紫衫素含量進(jìn)行了分析,，發(fā)現(xiàn)紫衫素主要在Taxus植物的根部積累，而在針葉和樹皮中的含量則相對較低,。
接著,，他們對紫衫素生物合成途徑中已知基因的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)這些基因在根部高度表達(dá),，與紫衫素的含量分布密切相關(guān),。
進(jìn)一步地，研究人員對CYP725A家族基因的組織特異性表達(dá)模式進(jìn)行了分析,，并從中篩選出了17個潛在的候選基因,。
為了鑒定這些候選基因中是否含有合成紫衫素所需的C9羥基化酶，研究人員在煙草植物中逐一表達(dá)了這些候選基因,，并同時表達(dá)了已知的紫衫素生物合成基因,。他們通過檢測是否能夠合成紫衫素來評估這些候選基因的功能。
實驗結(jié)果顯示,，只有Chr9_26460669基因的表達(dá)使得煙草能夠合成紫衫素,。這一發(fā)現(xiàn)證實了Chr9_26460669基因編碼了C9羥基化酶，并被命名為T9αH1,。
為了進(jìn)一步驗證T9αH1的C9羥基化酶活性,，研究人員在煙草中表達(dá)了T9αH1，并成功檢測到了紫衫素的生成,。
通過這一系列精妙的實驗步驟,，研究人員不僅成功從候選基因中篩選并鑒定出了C9羥基化酶T9αH1，而且補了巴卡丁III生物合成途徑中的一個關(guān)鍵空白,。
（圖片來自原文）
人工重建巴卡丁III生物合成途徑
研究人員首先在煙草葉片中同時共表達(dá)了已知參與巴卡丁III生物合成的基因,，包括TXS、T5αH,、T13αH,、T2αH、T7βH,、TAT和TBT,。
接著，他們在上述已知基因的基礎(chǔ)上，加入了新發(fā)現(xiàn)的兩個關(guān)鍵基因TOT和T9αH,，為巴卡丁III的生物合成途徑增添了新的力量,。
隨后,，研究人員在煙草葉片提取物中檢測到了一個新產(chǎn)物峰,，其質(zhì)譜和保留時間與巴卡丁III一致，這表明他們可能已經(jīng)成功合成巴卡丁III,。
為了進(jìn)一步確認(rèn)這個新產(chǎn)物的身份,，研究人員運用了MS/MS分析技術(shù)，結(jié)果確認(rèn)該新產(chǎn)物確實是巴卡丁III,。
為了鑒定巴卡丁III生物合成的核心途徑,，研究人員逐一移除了每個基因，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)所有9個基因同時表達(dá)時才能產(chǎn)生巴卡丁III,，這證明了這9個基因構(gòu)成了巴卡丁III生物合成的核心途徑,。
（圖片來自原文）
此外，他們還發(fā)現(xiàn)TAT不僅可以催化C10位的乙?；?，而且T10βH在C10位氧化反應(yīng)中可以被T5αH等其他酶取代。
特別值得注意的是,，盡管DBAT被認(rèn)為是C10位乙?；年P(guān)鍵酶，但研究人員發(fā)現(xiàn),，即使在沒有DBAT的情況下,，巴卡丁III仍然可以合成，這表明TAT可能也具有C10位的乙?；δ?。
通過人工共表達(dá)關(guān)鍵基因，研究人員成功地在煙草中重建了巴卡丁III的生物合成途徑,，為進(jìn)一步通過合成生物學(xué)生產(chǎn)紫杉醇提供了堅實的基礎(chǔ),。
核心基因的功能協(xié)同
在探索巴卡丁 III 生物合成過程的奧秘中，研究人員發(fā)現(xiàn)了一系列核心基因之間功能協(xié)同性的顯著特征,。首先,，TOT、T9αH等基因主要在根部表達(dá),，與下游基因的表達(dá)模式相似,，表明這些基因在組織水平上存在協(xié)同表達(dá)的現(xiàn)象。
其次,，經(jīng)過茉莉酸處理后,，這些基因的表達(dá)模式呈現(xiàn)協(xié)同上調(diào)的趨勢，與下游基因的表達(dá)模式相似，這提示茉莉酸可能參與協(xié)同調(diào)控這些基因,。
此外,，這些基因的表達(dá)之間存在顯著的正相關(guān)性，而與T14βH的表達(dá)模式不同,，這表明它們之間存在協(xié)同調(diào)控關(guān)系,。
在亞細(xì)胞水平上，這些酶主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),，與質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)中的酶存在協(xié)同作用,，形成協(xié)同代謝途徑。
進(jìn)一步地,，這些基因構(gòu)成的代謝網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀而非線性,，形成協(xié)同的代謝途徑。
最后,，這些基因在染色體上的分布位置存在關(guān)聯(lián),，暗示它們之間可能存在協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。
綜合來看,，這些核心基因在表達(dá)模式,、調(diào)控、亞細(xì)胞定位,、代謝途徑等方面存在協(xié)同性,，共同參與巴卡丁 III 的生物合成過程。
（圖片來自原文）
綜上所述,，本研究確定了紫杉科植物中催化生成抗癌藥物紫杉醇的關(guān)鍵酶,。紫杉醇的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包含一個功能化的二萜核心骨架(巴卡丁III)和苯異戊烯?；鶄?cè)鏈,。盡管在過去五十年中進(jìn)行了大量的研究，但巴卡丁III的完整生物合成途徑仍不清楚,。研究人員通過對紫杉醇生物合成途徑的篩選,，發(fā)現(xiàn)了一個雙功能細(xì)胞色素P450酶TOT1,它催化了紫杉醇中氧雜環(huán)的形成。通過共表達(dá)其他已知的參與巴卡丁 III合成的基因,，研究人員成功地在煙草中人工重建了巴卡丁 III的生物合成途徑,。這項研究為利用合成生物學(xué)手段綠色高效制造紫杉醇提供了可能。
翌圣助力產(chǎn)品
在該研究中,，研究團(tuán)隊使用了翌圣生物染料法熒光定量qPCR試劑進(jìn)行基因表達(dá)分析：
(圖片來自原文)
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[2] Seki T, Yang Y, Sun X, et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 2022;608(7922):421-428. doi:10.1038/s41586-022-05030-3. (IF=69.504)
[3] Chen P, Wang W, Liu R, et al. Olfactory sensory experience regulates gliomagenesis via neuronal IGF1. Nature. 2022;606(7914):550-556. doi:10.1038/s41586-022-04719-9.(IF=69.504)
[4] Dong W, Zhu Y, Chang H, et al. An SHR-SCR module specifies legume cortical cell fate to enable nodulation. Nature. 2021;589(7843):586-590. doi:10.1038/s41586-020-3016-z.(IF=69.504)
[5] Lu XY, Shi XJ, Hu A, et al. Feeding induces cholesterol biosynthesis via the mTORC1-USP20-HMGCR axis. Nature. 2020;588(7838):479-484. doi:10.1038/s41586-020-2928-y.(IF=69.504)
[6] Bi X, Wang K, Yang L, et al. Tracing the genetic footprints of vertebrate landing in non-teleost ray-finned fishes. Cell. 2021;184(5):1377-1391.e14. doi:10.1016/j.cell.2021.01.046.(IF=66.850)
[7] Liu S, Hua Y, Wang J, et al. RNA polymerase III is required for the repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination. Cell. 2021;184(5):1314-1329.e10. doi:10.1016/j.cell.2021.01.048.(IF=66.850)
[8] Liu CX, Li X, Nan F, et al. Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity. Cell. 2019;177(4):865-880.e21. doi:10.1016/j.cell.2019.03.046.(IF=66.850)
[9] Han X, Wang R, Zhou Y, et al. Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq. Cell. 2018;172(5):1091-1107.e17. doi:10.1016/j.cell.2018.02.001.(IF=66.850)
[10] Chai Q, Yu S, Zhong Y, et al. A bacterial phospholipid phosphatase inhibits host pyroptosis by hijacking ubiquitin. Science. 2022;378(6616):eabq0132. doi:10.1126/science.abq0132.(IF=63.714)
[11] Yu Q, Liu S, Yu L, et al. RNA demethylation increases the yield and biomass of rice and potato plants in field trials. Nat Biotechnol. 2021;39(12):1581-1588. doi:10.1038/s41587-021-00982-9.(IF=68.164)
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[15] Wang X, Ni L, Wan S, et al. Febrile Temperature Critically Controls the Differentiation and Pathogenicity of T Helper 17 Cells. Immunity. 2020;52(2):328-341.e5. doi:10.1016/j.immuni.2020.01.006.(IF=43.474)
[16] Xiao J, Li W, Zheng X, et al. Targeting 7-Dehydrocholesterol Reductase Integrates Cholesterol Metabolism and IRF3 Activation to Eliminate Infection. Immunity. 2020;52(1):109-122.e6. doi:10.1016/j.immuni.2019.11.015.(IF=43.474)
[17] Zhang X, Zhang C, Qiao M, et al. Depletion of BATF in CAR-T cells enhances antitumor activity by inducing resistance against exhaustion and formation of central memory cells. Cancer Cell. 2022;40(11):1407-1422.e7. doi:10.1016/j.ccell.2022.09.013.(IF=38.585)
[18] Wang XY, Wei Y, Hu B, et al. c-Myc-driven glycolysis polarizes functional regulatory B cells that trigger pathogenic inflammatory responses. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):105. Published 2022 Apr 18. doi:10.1038/s41392-022-00948-6.(IF=38.104)
[19] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):275. Published 2020 Nov 24. doi:10.1038/s41392-020-00408-z.(IF=38.104)
[20] Ren Y, Wang A, Wu D, et al. Dual inhibition of innate immunity and apoptosis by human cytomegalovirus protein UL37x1 enables efficient virus replication. Nat Microbiol. 2022;7(7):1041-1053. doi:10.1038/s41564-022-01136-6.(IF=30.964)
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