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圖1. 2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主[1]

CRISPR是“成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列"(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)的縮寫(xiě),，CRISPR系統(tǒng)是原核生物（包括細(xì)菌和古生菌）的一種天然防御機(jī)制，用于抵御噬菌體病毒的感染,。

CRISPR/Cas系統(tǒng)由兩個(gè)部分：CRISPR基因序列與Cas基因組成,。

CRISPR基因序列

由前導(dǎo)序列(leader)、重復(fù)序列(repeat)和間隔序列(spacer)構(gòu)成：

1）前導(dǎo)序列：一段富含AT堿基的數(shù)百個(gè)堿基對(duì),，坐落于CRISPR基因的上游,，并發(fā)揮著啟動(dòng)子的關(guān)鍵作用。

2）間隔序列：細(xì)菌所俘獲的外源DNA片段的記錄,，它們像是CRISPR系統(tǒng)的“記憶庫(kù)",，當(dāng)相同的外源遺傳物質(zhì)再次嘗試入侵時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)會(huì)精準(zhǔn)地識(shí)別并予以打擊,。

3）重復(fù)序列：長(zhǎng)度約20–50bp堿基,，內(nèi)含5–7bp的回文序列，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能夠形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),，從而穩(wěn)定RNA的整體二級(jí)結(jié)構(gòu),。這些重復(fù)序列與間隔序列相互交錯(cuò)，數(shù)量從幾個(gè)到數(shù)百個(gè)不等,。

cas基因

Cas基因,，位于CRISPR基因附近或散布于整個(gè)基因組的其他位置,，它們所編碼的蛋白質(zhì)包括Cas1至Cas10等。這些蛋白質(zhì)在CRISPR/Cas系統(tǒng)中扮演著關(guān)鍵角色,，與CRISPR基因序列協(xié)同工作,，共同構(gòu)成了這一強(qiáng)大的防御機(jī)制，從而保護(hù)原核生物免受噬菌體病毒的侵害,。

圖2. CRISPR位點(diǎn)結(jié)構(gòu)圖[2]

CRISPR/Cas系統(tǒng),，根據(jù)其Cas蛋白的組成差異以及效應(yīng)復(fù)合物的特性，可以被分為兩大類(lèi)：Class1和Class2,。

Class1系統(tǒng)：

這個(gè)類(lèi)別的系統(tǒng)特征在于它包含一個(gè)由多個(gè)Cas蛋白構(gòu)成的效應(yīng)模塊,。該模塊承擔(dān)著識(shí)別目標(biāo)基因組、失活入侵DNA以及處理前CRISPR RNA（也稱為pre-crRNA）的關(guān)鍵任務(wù),。

Class2系統(tǒng)：

與Class1不同,，Class2系統(tǒng)的標(biāo)志性特征是它包含一個(gè)單一的多結(jié)構(gòu)域CrRNA結(jié)合蛋白，比如在Class2系統(tǒng)中的Cas9,。這種蛋白質(zhì)具備實(shí)現(xiàn)干擾所需的全部活性,，并且在一些變體中，它還整合了參與前crRNA加工的活性,。

圖3. CRISPR系統(tǒng)分類(lèi)[3]

CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Cas基因可以歸納為四個(gè)不同但部分重疊的功能模塊：適應(yīng)模塊,、表達(dá)處理模塊、干擾或效應(yīng)模塊,、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或輔助模塊,，這些模塊共同協(xié)作以實(shí)現(xiàn)其基因組編輯的能力。

1）適應(yīng)模塊：負(fù)責(zé)將新的遺傳信息整合到CRISPR序列中,。它包括編碼關(guān)鍵酶Cas1（負(fù)責(zé)間隔序列的插入）和適應(yīng)復(fù)合體亞單位Cas2的基因,。此外，它還可能包含Cas4核酸酶,、II-A亞型中的Csn2蛋白以及許多III型系統(tǒng)中的逆轉(zhuǎn)錄酶。

2）表達(dá)處理模塊：負(fù)責(zé)前crRNA處理,。在大多數(shù)Class1系統(tǒng)中,，Cas6是直接負(fù)責(zé)這一過(guò)程的酶。而在II型系統(tǒng)中,，這一任務(wù)由細(xì)菌RNase III（一種非Cas蛋白）完成,。在許多V型系統(tǒng)和所有VI型系統(tǒng)中，大型效應(yīng)Cas蛋白內(nèi)含一個(gè)專門(mén)的催化中心來(lái)處理前crRNA,。

3）干擾或效應(yīng)模塊：涉及目標(biāo)識(shí)別和核酸裂解,。在Class1系統(tǒng)中，效應(yīng)蛋白模塊由多種Cas蛋白組成,，如Cas3,、Cas5-Cas8,、Cas10和Cas11等。而在Class2系統(tǒng)中,，效應(yīng)蛋白模塊簡(jiǎn)化為單一的大蛋白,，如Cas9、Cas12或Cas13,。

4）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或輔助模塊：這是一個(gè)包含眾多CRISPR連鎖基因的廣泛集合,，它們?cè)贑RISPR-Cas系統(tǒng)中的作用大多是初步預(yù)測(cè)的。

由于Class2系統(tǒng)的簡(jiǎn)便性和易用性,，研究者主要關(guān)注Class2系統(tǒng)中的Cas亞型,，以尋找潛在的新基因組編輯和診斷工具。Class2 CRISPR-Cas系統(tǒng)主要包括三種類(lèi)型：II型（cas9）,、V型（cas12）和VI型（cas13）,。

II型系統(tǒng)

Ⅱ型系統(tǒng)中的代表為CRISPR/Cas9蛋白系統(tǒng)，Cas1,、Cas2,、Cas4蛋白負(fù)責(zé)重復(fù)間隔區(qū)的建立，RNaseⅢx協(xié)助crRNA的形成,，而剩余的工作由Cas9蛋白完成,。Cas9發(fā)揮功能時(shí)需要tracrRNA與crRNA共同作用（tracrRNA促進(jìn)crRNA加工成熟，通過(guò)堿基配對(duì)與crRNA結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合,，用于結(jié)合Cas9蛋白,；crRNA與基因組DNA互補(bǔ)配對(duì)，用于結(jié)合模板DNA）,，當(dāng)向?qū)NA與Cas9蛋白形成復(fù)合物后,，Cas9蛋白的兩個(gè)DNA切割結(jié)構(gòu)域（HNH和RuvC）發(fā)揮切割活性，HNH結(jié)構(gòu)域切割與crRNA互補(bǔ)的鏈,，RuvC結(jié)構(gòu)域切割另一條鏈,，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)DNA的雙鏈切割，這種精準(zhǔn)的切割能力使得CRISPR/Cas9系統(tǒng)成為了基因編輯領(lǐng)域中強(qiáng)大,、高效的工具之一,。

V型系統(tǒng)

V型系統(tǒng)的單一效應(yīng)蛋白為Cas12，與II型系統(tǒng)存在顯著差異,。II型系統(tǒng)依賴于兩個(gè)DNA切割結(jié)構(gòu)域——HNH和RuvC,，而V型系統(tǒng)則僅擁有一個(gè)與RuvC相似的切割活性結(jié)構(gòu)域；在guideRNA上,，Cas9系統(tǒng)需要tracrRNA與crRNA的協(xié)同作用,，而Cas12a系統(tǒng)則僅憑單一的crRNA便能完成使命。

值得一提的是,，Cas9蛋白在切割雙鏈DNA后,，產(chǎn)生的DNA末端為平末端,。相比之下，Cas12a系統(tǒng)則會(huì)產(chǎn)生粘性末端,，這一特性為其在基因編輯和核酸檢測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了更多可能性,。

此外，像Cas12a,、Cas12b這樣的系統(tǒng)還具有反式切割活性,。在crRNA的引導(dǎo)下，Cas12a能夠特異性地識(shí)別和切割雙鏈DNA（dsDNA）,，并隨后釋放單鏈脫氧核糖核酸酶（ssDNase）活性,。這種活性使得Cas12a能夠無(wú)差別地裂解附近的單鏈DNA（ssDNA）。因此,，Cas12a系統(tǒng)可以與LAMP等技術(shù)相結(jié)合,，為核酸檢測(cè)等領(lǐng)域提供強(qiáng)大的工具。

圖4. 主要的CRISPR/Cas基因編輯工具[4]

VI型系統(tǒng)

VI型系統(tǒng)的單一的效應(yīng)蛋白為Cas13,，具有靶向切割目標(biāo)RNA的能力,。Cas13含有兩個(gè)高等真核生物和原核生物核苷酸(HEPN)結(jié)合域結(jié)構(gòu)，其上的RxxxxH保守基序是Cas13核酸酶催化活性位點(diǎn),。Cas13僅憑單個(gè)crRNA的引導(dǎo),，便能催化自身的前體pre-crRNA轉(zhuǎn)化為成熟的crRNA，當(dāng)crRNA-Cas13a復(fù)合物形成時(shí),，crRNA便會(huì)引導(dǎo)復(fù)合物與靶標(biāo)RNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì),。通過(guò)這種機(jī)制，Cas13能夠特異性地對(duì)靶標(biāo)RNA進(jìn)行順式剪切,，從而實(shí)現(xiàn)RNA敲除的目的,。此外，Cas13還能以非特異性的方式對(duì)附近的RNA進(jìn)行反式剪切,，這一特性使其在基因編輯和RNA調(diào)控領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景,。

CRISPR/Cas系統(tǒng)的具體作用機(jī)可分為以下三個(gè)階段：

當(dāng)被外源噬菌體或質(zhì)粒侵入時(shí)，含有CRISPR的細(xì)菌和古菌獲得插入間隔區(qū)的外源DNA片段,；

當(dāng)與間隔區(qū)同源的外來(lái)核酸再次進(jìn)入細(xì)菌時(shí),，CRISPR陣列會(huì)被激活并轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前體crRNA（pre-crRNA）。同時(shí),，與pre-crRNA序列互補(bǔ)的tracrRNA也會(huì)被轉(zhuǎn)錄出來(lái)，tracrRNA在轉(zhuǎn)錄后會(huì)首先與Cas9蛋白結(jié)合,，隨后與pre-crRNA通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)形成雙鏈RNA,。這個(gè)雙鏈RNA與Cas9蛋白結(jié)合，形成一個(gè)功能強(qiáng)大的復(fù)合物,。

在RNase III的作用下,，pre-crRNA經(jīng)歷初級(jí)和二次加工,，多余的重復(fù)序列和間隔序列被去除，從而生成成熟的crRNA,。這個(gè)成熟的crRNA具備了靶向特定DNA鏈的能力,。

若細(xì)菌再次遭受同源DNA的感染，它會(huì)啟動(dòng)CRISPR區(qū)域的轉(zhuǎn)錄,，經(jīng)過(guò)一系列的加工和成熟過(guò)程,，生成單鏈向?qū)NA（sgRNA），sgRNA會(huì)引導(dǎo)Cas9蛋白精確地剪切并破壞同源間隔區(qū)域的DNA鏈,，導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂（DSB）,，隨后，細(xì)胞會(huì)通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）的方式對(duì)靶基因進(jìn)行修復(fù),。這一過(guò)程中,，CRISPR/Cas系統(tǒng)展現(xiàn)出了其精確的靶向干擾能力，從而有效地抵御了外源遺傳物質(zhì)的入侵,。

圖5. CRISPR-Cas9介導(dǎo)的DNA干擾細(xì)菌適應(yīng)性免疫[5]

RISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)依賴于兩大核心組件：具備導(dǎo)向功能的gRNA和Cas9蛋白,。其技術(shù)原理涵蓋了兩個(gè)基本過(guò)程：gRNA引導(dǎo)的Cas9靶向DNA切割，以及隨后的DNA修復(fù),。

在Cas9靶向DNA切割階段,，CRISPR系統(tǒng)識(shí)別DNA上的特定位置，這一識(shí)別過(guò)程依賴于crRNA（負(fù)責(zé)識(shí)別）和tracrRNA（作為Cas9的結(jié)合支架）的序列,。當(dāng)這兩者融合轉(zhuǎn)錄出sgRNA后,，sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，通過(guò)sgRNA與20bp靶序列的互補(bǔ)配對(duì),，Cas9核酸內(nèi)切酶被精確引導(dǎo)至靶切割位點(diǎn),，切割從PAM（即復(fù)合體識(shí)別的富含GC的三堿基序列，如5′-NGG-3′）上游的第三個(gè)堿基開(kāi)始,。Cas9核酸內(nèi)切酶包含兩個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域：HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域和RuvC-like核酸酶結(jié)構(gòu)域,。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同工作，共同切割DNA,。其中,，HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈，而RuvC-like結(jié)構(gòu)域則切割另一條非互補(bǔ)鏈,。切割位點(diǎn)位于PAM上游原始間隔序列的第3和第4個(gè)核苷酸之間,，產(chǎn)生平末端的DSB（雙鏈斷裂）。一旦Cas9/sgRNA復(fù)合物誘導(dǎo)產(chǎn)生DSBs,，機(jī)體將啟動(dòng)兩種修復(fù)方式,，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控。

圖6. CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯機(jī)制[6]

1）非同源末端連接（NHEJ）

非同源末端連接（NHEJ）是修復(fù)雙鏈斷裂（DSB）的經(jīng)典通路。在這一過(guò)程中,，斷端會(huì)經(jīng)歷核酸酶的精細(xì)修剪和DNA聚合酶的空隙填補(bǔ),，然而，這種修復(fù)方式會(huì)在DNA上留下“痕跡",，可能是修復(fù)過(guò)程中錯(cuò)誤插入或缺失的堿基,。當(dāng)這些“痕跡"出現(xiàn)在基因組的編碼蛋白基因區(qū)域時(shí)，會(huì)導(dǎo)致基因編碼的蛋白序列出現(xiàn)異常,，進(jìn)而造成相應(yīng)蛋白功能的失調(diào),。

然而如果“痕跡"出現(xiàn)在基因組的非編碼區(qū)，其對(duì)細(xì)胞的整體功能通常不會(huì)造成顯著影響,。例如,，在基因敲除實(shí)驗(yàn)中，我們常常選擇在翻譯起始位點(diǎn)后的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)gRNA,，以確保其盡可能靠近mRNA的5’端,。這樣做的目的是，插入或缺失的堿基會(huì)干擾正常的密碼子讀碼,，導(dǎo)致翻譯過(guò)程提前終止,，從而破壞目標(biāo)基因的表達(dá)或使其功能喪失。

2）同源重組修復(fù)（HDR）

同源重組修復(fù)（HDR）是一種基于遺傳重組的DNA修復(fù)機(jī)制,，它發(fā)生在兩個(gè)相似或相同的DNA分子核苷酸序列之間,。HDR的一個(gè)顯著特點(diǎn)是，在修復(fù)過(guò)程中不會(huì)引入額外的核苷酸缺失或增加,，因此它能夠精確地修復(fù)DNA雙鏈的斷裂,。例如，在制備疾病相關(guān)突變模型時(shí),，我們可以通過(guò)外源提供包含所需突變的靶基因模板,，然后利用HDR機(jī)制，在Cas9蛋白切割DNA后,，將突變模板精確地整合到基因組中,。

CRISPR/Cas技術(shù)作為新一代基因編輯技術(shù)的代表，具有極為廣闊的應(yīng)用前景,。在本文中,，我們向大家介紹了CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本組成和編輯機(jī)制。而在接下來(lái)的文章中,，我們將深入探討CRISPR/Cas技術(shù)的遞送形式及應(yīng)用,，敬請(qǐng)期待！