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克隆技術(shù)，又稱為“生物放大技術(shù)",，目前應用泛的技術(shù)為“分子克隆",，即通過重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設(shè)計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達,，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù),。
前兩期小翌給小伙伴們介紹了一些傳統(tǒng)的、應用范圍廣的,、新型的分子克隆方法,。相信大家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，大部分的分子克隆方法,，諸如傳統(tǒng)分子克隆,、TA克隆、Gatway克隆,、TOPO克隆,、無縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備,、連接,、轉(zhuǎn)化、篩選等等步驟,，接下來小翌就具體解析一下載體和目的片段制備的過程,，為您的實驗提供好方法。
圖1.無縫克隆關(guān)鍵步驟
目的片段：目的片段來源為基因組DNA,、另一質(zhì)粒的一部分或者線性DNA片段等,。制備目的片段時常用的方法有兩種，方法一是通過PCR擴增片段或者載體上的目的序列,，在此過程中,，如果制備目的片段是為了在下游進行傳統(tǒng)的酶切酶連方式，就需要引入限制性酶切位點，設(shè)計與線性載體兩端相同的酶切位點,，以便酶切后通過匹配的粘性末端進行連接,；如果制備目的片段是為了在下游進行同源重組，則需要引入15-25 bp的上下游同源臂,。
首先,，通過翌圣的無縫克隆引物設(shè)計軟件 設(shè)計引物。輸入需要的載體序列和目的片段序列,，選擇合適的酶切位點,，生成引物，如圖2所示,。
圖2.翌圣引物設(shè)計流程
值得注意的是,，多個目的片段插入的雙酶切位點，實際添加到第一個片段的5’端和最后一個片段的3’端,，中間片段不含有設(shè)計的酶切位點,。之后，通過引物合成公司合成需要的引物序列,。接著,，利用PCR技術(shù)擴增目的片段，如使用翌圣高保真PCR試劑盒（Cat#10164ES）,，包含高保真DNA聚合酶,，擴增目的片段快速簡便、靈敏度高,、特異性強,；或使用翌圣快速PCR試劑盒（Cat#10157ES），3 kb以內(nèi)基因組等復雜模板擴增速度可達1-3 sec/kb,，5 kb以內(nèi)質(zhì)粒等簡單模板擴增速度可達1 sec/kb,，具有Taq DNA聚合酶，擴增后的PCR產(chǎn)物具有3’-dA突出端,，可輕松克隆至T載體,。
圖3. 10906ES連接2000 bp（50 ng）粘性末端片段圖
A：載體和片段均來自南京某高校,；B：插入片段PCR鑒定電泳圖
擴增后產(chǎn)物需要進行純化。有兩種方法,，一種是使用翌圣瓊脂糖（Cat#10208ES）配制凝膠,，電泳后切割出目標片段進行純化，如使用翌圣的瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Cat#19101ES）能保證實驗流程高效,、結(jié)果可靠,、得率高。另一種是直接取PCR產(chǎn)物純化,，如使用翌圣PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Cat#19106ES）,，操作簡便，15 min即可完成PCR產(chǎn)物純化,。
載體：將目的DNA序列通過基因工程手段送到受體細胞所需的運載工具,。常見的載體有質(zhì)粒，病毒和噬菌體,。當前基因工程中的載體是質(zhì)粒,。
所有基于質(zhì)粒的克隆載體包括：確保在細菌宿主細胞內(nèi)能有效增殖的復制原；單一酶切位點,，或多克隆位點（MCS）,，后者含有一系列酶切位點，可供目的片段插入,；載體成功轉(zhuǎn)化后的細菌篩選標記（例如,，抗生素耐受）。
pET系列載體是目前應用泛的重組蛋白表達載體,，載體構(gòu)建時目的片段被克隆入載體噬菌體T7轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)下,，經(jīng)轉(zhuǎn)化在宿主T7 RNA聚合酶的誘導下進行表達。T7 RNA聚合酶具有并特異的啟動T7啟動子基因表達功能,，當其被誘導時,，可使宿主本身的表達幾乎全部轉(zhuǎn)化為目的基因的表達，誘導幾個小時后即可使得最終目的基因表達產(chǎn)物超過細胞總蛋白的50%,。
翌圣pET-28a(+) Vector表達載體（Cat#11905ES）載體帶有一個N端的His/Thrombin/T7蛋白標簽,，同時含有一個可以選擇的C端His標簽，還有單一的多克隆位點,，方便目的片段的克隆與表達,，載體圖譜如圖4所示。
圖4. 翌圣pET-28a(+) Vector表達載體圖譜
準備好載體后,，即可進行載體的制備,。其與目的片段制備方法相同,，可通過PCR擴增或限制性內(nèi)切酶酶切獲得線性化載體。限制性內(nèi)切酶的選擇取決于載體和插入片段上是否存在相應的識別序列,、識別序列的位置以及是否適于連接,。MCS往往是插入片段的，因為該區(qū)域?qū)Ｓ糜诳寺 ?/span>
翌圣的FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶能快速,、精準完成DNA切割,。載體酶切后，為防止自連,，有必要進行載體的去磷酸化,，尤其當載體酶切后末端可互補或是平端時。載體的去磷酸化對于降低背景,、促進所需片段插入載體非常重要,，翌圣小牛腸堿性磷酸酶（Cat#10321ES）可將DNA、RNA的5’端磷酸基團去除,，有效阻止載體的自連現(xiàn)象,。獲得的線性化載體也需要純化回收后使用。
圖5. 小牛腸堿性磷酸酶去DNA磷酸化示意圖
經(jīng)過上述步驟,，載體和目的片段都已整裝待發(fā),，是時候開展下一步的載體和片段連接反應了。那么連接反應中應用到的技術(shù)和試劑又有哪些呢,？關(guān)注我們,，小翌會在下一期的分子克隆技術(shù)專題中給大家具體講解分子克隆連接中應用到的技術(shù)，為您的實驗帶來新的思路與方向,，期待下一次的見面~
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 規(guī)格 |
5s/kb,，高保真PCR（含上樣染料） | 2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) | 10164ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
快速PCR，快至1s/kb | 2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) | 10157ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
常規(guī)PCR | 2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye) | 10102ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
兼容TA/平末端克隆 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES08/20 | 5 T/20 T |
高質(zhì)量瓊脂糖 | Agarose瓊脂糖 | 10208ES60/76 | 100 g/500 g |
瓊脂糖凝膠回收試劑盒 | MolPure® Gel Extraction Kit 瓊脂糖凝膠回收試劑盒 | 19101ES50/70 | 50 T/200 T |
PCR產(chǎn)物純化試劑盒 | MolPure® PCR Purification Kit PCR產(chǎn)物純化試劑盒 | 19106ES50/70 | 50 T/200 T |
表達載體 | pET-28a(+) Vector 表達載體 | 11905ES03 | 1 μg |
去DNA磷酸化 | Alkaline Phosphatase(30 U/μl),Calf Intestine(CIAP) 小牛腸堿性磷酸酶 | 10321ES80 | 1000 U |
通用緩沖液,，5min完成精準酶切 | FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶 | 15001ES-15051ES | 50 T |
