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漲知識(shí) | 克隆專題一：不同分子克隆方法介紹（上）
克隆是英文“clone"或“cloning"的音譯，而英文“clone"則起源于希臘文“Klone"，原意是指以幼苗或嫩枝插條。1963年J.B.S.Haldane在題為“人類種族在未來(lái)二萬(wàn)年的生物可能性"的演講上采用“克?。–lone）"的術(shù)語(yǔ),，把“克隆技術(shù)"帶到了人們的視野中,。
克隆技術(shù)又稱為“生物放大技術(shù)",，目前應(yīng)用泛的技術(shù)為“分子克隆"，又稱重組DNA技術(shù),，即通過(guò)重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來(lái),，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù),。
隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入,，分子克隆技術(shù)也隨之更新迭代，從傳統(tǒng)的依賴限制性內(nèi)切酶的方法發(fā)展到如今的TA克隆,、TOPO克隆,、無(wú)縫克隆、Gateway技術(shù)等等,，新的技術(shù)不斷涌現(xiàn),，為分子生物學(xué)的發(fā)展和進(jìn)化提供新的力量。今天小翌就帶領(lǐng)大家認(rèn)識(shí)一下不同的分子克隆方法,。
傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的依賴于限制性內(nèi)切酶和酶切位點(diǎn),。主要步驟是通過(guò)限制性內(nèi)切酶（翌圣的FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶Cat#15001ES-15051ES）酶切載體和目的基因，通過(guò)連接酶（翌圣T4 DNA連接酶Cat#10300）將酶切的片段拼接在一起（即連接過(guò)程）,，形成可以表達(dá)目的基因的新載體（即重組質(zhì)粒）,，使用轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目的基因的擴(kuò)增,、轉(zhuǎn)錄和翻譯,。
傳統(tǒng)分子克隆實(shí)驗(yàn)流程如下圖：
圖1.傳統(tǒng)分子克隆實(shí)驗(yàn)流程
該技術(shù)最早由Cohen Group在1973年實(shí)現(xiàn)，他們將E.coli的tetr質(zhì)粒psclol和nersrR6-3質(zhì)粒體外限制酶切割,，連接成新的質(zhì)粒,，轉(zhuǎn)化E.coli,，在含四環(huán)素和新霉素的平板上篩選出了terrNer，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移,。傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)較為成熟,，但是該方法受到限制性酶切位點(diǎn)和連接效率等方面的限制，并不能高效,、準(zhǔn)確的克隆需要的目的基因,。
圖2. Stanley Cohen和Herbert Boyer（第一個(gè)成功實(shí)現(xiàn)基因工程技術(shù)的團(tuán)隊(duì)）
圖3. TA克隆流程示意圖【3】
圖4. TOPO克隆原理
圖5. TOPO TA/Blunt克隆試劑盒輕松連接2 kb（10 ng）平末端/粘性末端片段
注：A&B：TOPO克隆轉(zhuǎn)化平板。C&D：插入片段PCR鑒定電泳圖,。
圖6.同源重組原理
Gibson Assembly：包含T5 exonuclease,、Phusion DNA polymerase和Taq DNA Ligase三種酶，通過(guò)5’→3’ T5核酸外切酶活性,，沿著5’→3’方向降解dsDNA,，產(chǎn)生3’黏性末端，通過(guò)同源臂互補(bǔ)配對(duì),，退火后借助Phusion DNA聚合酶修復(fù)片段上的缺口,，Taq DNA連接酶催化片段形成磷酸二酯鍵，將所有缺口補(bǔ)齊,，獲得重組片段,。
圖7. Gibson Assembly原理圖【5】
圖8. In-Fusion Cloning原理【6】
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 規(guī)格 |
通用緩沖液，5min完成精準(zhǔn)酶切 | FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶 | 15001ES-15051ES | 50 T |
常規(guī)PCR | 2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye) | 10102ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
常規(guī)PCR,，不含染料 | 2×Hieff® PCR Master Mix(No Dye) | 10103ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
快速PCR,，快至1s/kb | 2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) | 10157ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
TOPO克隆-兼容TA/平末端 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES20 | 20 T |
TOPO克隆-TA末端 | Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒 | 10907ES20 | 20 T |
TOPO克隆-平末端 | Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit | 10909ES20 | 20 T |
單片段一步克隆，已發(fā)文章累計(jì)IF達(dá)到1000+ | Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆試劑盒 | 10911ES20/50 | 20 T/50 T |
1-6片段一步克隆,，最快5分鐘完成重組反應(yīng) | Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆試劑盒 | 10922ES20/50 | 20 T/50 T |
參考文獻(xiàn)
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