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復(fù)制型病毒/病毒載體回復(fù)突變（Replication Competent Virus, RCV），可產(chǎn)生于病毒載體制造過程中的所有步驟當(dāng)中。并且,，RCV感染宿主細(xì)胞后能隨宿主細(xì)胞在培養(yǎng)液中增殖,、擴(kuò)增對人體健康具有嚴(yán)重的隱患，是免疫細(xì)胞治療類產(chǎn)品,，如CAR-T產(chǎn)品的主要安全性風(fēng)險(xiǎn)之一,。近年來，CAR-T細(xì)胞制備過程中,，伴隨載體的不斷升級優(yōu)化,，重組產(chǎn)生的復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒(Replication Competent Retrovirus / Lentivirus, RCR/RCL)逐漸降低，但產(chǎn)生RCR/RCL的風(fēng)險(xiǎn)隱患至今仍不能排除,。由2022年5月發(fā)布的《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》指出RCR/RCL檢測作為安全性檢測在細(xì)胞藥物的研發(fā)和生產(chǎn)過程中至關(guān)重要,，相關(guān)產(chǎn)品不得檢出RCR/RCL，可知病毒載體相關(guān)產(chǎn)品中,，RCR/RCL的檢測至關(guān)重要,。
慢病毒( lentivirus，LV) 載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒( human immunodeficiency virus,，HIV-1) 為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體,，它源于逆轉(zhuǎn)錄病毒，但又有所不同,。LV與一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比較,，具有感染能力強(qiáng)、容納更大目的片段的基因,、能感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞和很少引發(fā)免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn),，目前被選為CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的主要病毒載體。
《CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點(diǎn)》一文提到：目前 RCR/RCL 的檢測方法主要有指示細(xì)胞培養(yǎng)法,、ELISA法(p24蛋白測定),、PCR/q-PCR法（通過psi-gag或VSV-G聚合酶鏈反應(yīng)）和轉(zhuǎn)錄酶活性測定法(PERT)等。其中,，利用指示細(xì)胞培養(yǎng)法對生產(chǎn)過程中的病毒（上清液,、病毒生產(chǎn)終末期細(xì)胞）存在的RCL進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，并在培養(yǎng)終點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)檢測是FDA推薦的RCL檢測方法,。
指示細(xì)胞培養(yǎng)法分為2個(gè)階段,，初始擴(kuò)增階段和指示階段：初始擴(kuò)增階段是將待測樣品與C8166-45細(xì)胞（人類臍帶血淋巴細(xì)胞）共培養(yǎng)21天，至少傳代5次后收集細(xì)胞上清,，分別采用ELISA法測定培養(yǎng)基中的P24蛋白表達(dá)量和與新的C8166-45細(xì)胞一起共培養(yǎng),，7 d后采用2種不同原理的方法檢測RCL，如ELISA,、PCR或qPCR(psi-gag／VSV-G PCR,，ELISA p24,，PERT)。RCL指示細(xì)胞培養(yǎng)法分組和檢測如圖1和2,。
圖1.指示細(xì)胞共培養(yǎng)分組
圖2.RCL檢測方法
根據(jù)現(xiàn)有法規(guī)和指導(dǎo)原則可以發(fā)現(xiàn),，RCL的檢測方法主要包含指示細(xì)胞培養(yǎng)法、ELISA法,、PCR/q-PCR法和PERT法,。因?yàn)橹甘炯?xì)胞培養(yǎng)法檢測需28天，并且因?yàn)殛栃詫φ詹《镜男再|(zhì),，要求其需要在P3或者P2實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中進(jìn)行,，致使該方法具有耗時(shí)長，環(huán)境要求高的特點(diǎn),。相比而言,基于VSV-G序列的q-PCR方法或基于psi-gag序列的PCR方法,，因其具有檢測時(shí)間短、環(huán)境條件簡單,、靈敏度高和可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),，被許多CAR-T申報(bào)企業(yè)作為快速放行方法。
除卻指示細(xì)胞培養(yǎng)法,，其他3種快速檢測RCL的檢測方法優(yōu)缺點(diǎn)如下：
ELISA 法(p24 蛋白測定)：適用于由載體生產(chǎn)過程中病毒基因組之間的重組形成RCL的檢測,。但，對于VSV-G 包膜質(zhì)粒和來源于其他病毒的 gal-pol 基因功能組件之間發(fā)生重組不表達(dá)p24蛋白的假型病毒不適用,。其優(yōu)點(diǎn)為適用性廣（濃縮載體,、終末細(xì)胞、血清血漿等多種樣本）,、靈敏度高和可定量等,。
使用qPCR的方法測定VSV-G基因和PCR方法檢測由病毒載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒重組產(chǎn)生的psi-gag基因序列，具有靈敏度高,，可重復(fù)性和操作簡單等優(yōu)點(diǎn),。
測定逆轉(zhuǎn)錄酶活性的方法，它可以用來檢測RCL相關(guān)的不同結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)病毒,，缺點(diǎn)為在某些細(xì)胞檢測中,，存在背景高的現(xiàn)象。
美國FDA要求對于采用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體的產(chǎn)品,，需要在整個(gè)生產(chǎn)過程及不同階段進(jìn)行RCL/RCR檢測,，針對載體生產(chǎn)用主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫,、生產(chǎn)終末細(xì)胞、載體上清液及在體外培養(yǎng)超過4天的載體轉(zhuǎn)到細(xì)胞進(jìn)行檢測,，具體如如圖3,。針對慢病毒載體使用時(shí)RCL的檢測,，除了金標(biāo)準(zhǔn)——指示細(xì)胞培養(yǎng)法，還需要選擇2種不同原理的快檢方法對其進(jìn)行補(bǔ)充檢測,。
圖3.RCL/RCR檢測階段
參考文獻(xiàn)：
1,、FDA. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) Guidance for Industry［S］2020．
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6,、《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》,，國家藥監(jiān)局藥品審評中心，2022.
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8,、《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》,國家藥監(jiān)局藥品審評中心,，2022.
9、《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》,國家藥監(jiān)局藥品審評中心,，2022.
10,、盧加琪, 李倩與何伍, 《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》解讀. 中國新藥雜志, 2023. 32(02): 第118-122頁.
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