日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

翌圣生物科技（上海）股份有限公司

初級(jí)會(huì)員·13年

聯(lián)系電話

400-6111-883

您現(xiàn)在的位置： 首頁> 技術(shù)文章 > 漲知識(shí) | qPCR專場(chǎng)五：如何分析熒光定量數(shù)據(jù)？
初級(jí)會(huì)員·13年
聯(lián)系人：
曹女士
電話：
400-6111-883
手機(jī)：
售后：
4006-111-883
傳真：
86-21-34615995
地址：
上海市浦東新區(qū)天雄路166弄1號(hào)3樓
網(wǎng)址：
www.yeasen.com

掃一掃訪問手機(jī)商鋪

漲知識(shí) | qPCR專場(chǎng)五：如何分析熒光定量數(shù)據(jù),？

2023-9-13　　閱讀(364)

分享：

漲知識(shí) | qPCR專場(chǎng)五：如何分析熒光定量數(shù)據(jù),？

 


熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室中出鏡率非常高的一種檢測(cè)方法。該方法通過在PCR體系中添加熒光基團(tuán)來記錄DNA產(chǎn)物的累積情況,，從而達(dá)到對(duì)PCR過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的,，并且可以通過數(shù)據(jù)分析計(jì)算出起始模板量，這就是“熒光定量"中“定量"一詞的來源,。

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)因?yàn)殪`敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里,，所以在實(shí)驗(yàn)過程中，我們需要注意諸多細(xì)節(jié),，謹(jǐn)慎操作,。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實(shí)驗(yàn),，拿到實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，發(fā)表高分文章，走上人生呢,？

 

熒光定量PCR可以通過將Ct值轉(zhuǎn)化為數(shù)量用以計(jì)算每個(gè)PCR反應(yīng)中初始的基因靶標(biāo)數(shù)量,。通常有兩種方法可以將Ct值轉(zhuǎn)化為數(shù)量，分別是絕對(duì)定量法和相對(duì)定量法,。絕對(duì)定量主要用于檢測(cè)未知樣品中核酸的具體量,，可通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知樣品的Ct值進(jìn)行比較實(shí)現(xiàn)定量，主要應(yīng)用于病原菌,、病毒檢測(cè)等領(lǐng)域,。而應(yīng)用泛的mRNA表達(dá)的研究中不需要知道具體有多少核酸量，只需要確定基因相對(duì)的表達(dá)差異，用相對(duì)定量的方法即可得到結(jié)果,。相對(duì)定量是指在一定樣品中目的基因相對(duì)于另一參照樣品中量的變化,，如比較樣品處理前后或不同時(shí)期目的基因的表達(dá)變化。與絕對(duì)定量相比,，相對(duì)定量更簡(jiǎn)單,，應(yīng)用更普遍。

 

 

絕對(duì)定量法
 
標(biāo)準(zhǔn)曲線模板的選擇
 
 
用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板的質(zhì)量對(duì)于實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒χ陵P(guān)重要,。測(cè)定初始拷貝數(shù)需要盡可能均勻的純模板,，常見的有DNA標(biāo)準(zhǔn)品和RNA標(biāo)準(zhǔn)品，不同的標(biāo)準(zhǔn)品有著各自的優(yōu)缺點(diǎn),。

 

 
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
 
 
在制作曲線之前,，需對(duì)模板準(zhǔn)確量化。確定模板中核酸的拷貝數(shù),，將模板按照梯度稀釋10倍,，稀釋成8-10種包含不同核酸拷貝數(shù)的模板。對(duì)不同稀釋程度的模板進(jìn)行熒光定量PCR,，每種模板進(jìn)行至少三次重復(fù),。由此得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線將具體拷貝數(shù)和特定的Ct值相關(guān)聯(lián),。將未知拷貝數(shù)模板熒光定量PCR后獲取的Ct值與該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較,，即可得到具體的拷貝數(shù)值。定量的準(zhǔn)確性和標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量直接相關(guān),。

 

 

 
標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證
 
 
制作完標(biāo)準(zhǔn)曲線后,，需進(jìn)行多項(xiàng)驗(yàn)證，用以確保標(biāo)準(zhǔn)曲線是有效且準(zhǔn)確的,。
主要驗(yàn)證的方面如下：

  • 線性范圍和靈敏度驗(yàn)證：檢測(cè)線性范圍中的最高點(diǎn)和點(diǎn)濃度,；

  • 模板質(zhì)量驗(yàn)證：分光光度計(jì)分析260/280、260/230比值,；

  • 數(shù)據(jù)精度驗(yàn)證：重復(fù)組內(nèi)的Ct值差距應(yīng)≤0.5,；

  • 擴(kuò)增效率驗(yàn)證：斜率盡可能接近-3.3，相當(dāng)于擴(kuò)增效率盡可能接近100%,，測(cè)試前后斜率盡可能一致,。

 

 

相對(duì)定量法
相對(duì)定量法中常見的是比較Ct法，其中主要包括2-ΔΔCt法,，Pfaffl法和ΔCT法,，目前諸多科研人員采用最多的是2-ΔΔCt法。雖然該方法應(yīng)用廣泛,，但是很多人卻不了解其中的原理,，例如為什么要用內(nèi)參基因的Ct值？為什么是ΔΔCt而不是ΔCt？為什么是負(fù)的ΔΔCt,？接下來,，小翌就為大家講解清楚。

 

 
2-ΔΔCt法講解
 
 

 

內(nèi)參基因通常是一種始終保持著低水平甲基化且一致處于活性轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的基因,，高度保守且在大多數(shù)情況下持續(xù)表達(dá),，其表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小。通常在檢測(cè)基因的表達(dá)水平時(shí)用作參照物,，校正操作,、上樣量差異等帶來的實(shí)驗(yàn)誤差，從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

理論狀態(tài)下,，PCR擴(kuò)增呈現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)，每次循環(huán)增加一倍的量,，用數(shù)學(xué)表示,，則為2的Ct次方。當(dāng)產(chǎn)物量到達(dá)同一水平，但對(duì)應(yīng)的Ct值不同，其原因在于初始的模板量差異,。將其做比,，可了解他們的模板量的差異，如下：

 

 

僅了解目的基因和內(nèi)參基因之間的初始模板量比值是難以判斷基因變化的情況(表達(dá)量變化的差異),，通常我們會(huì)選用正常組(野生型)和實(shí)驗(yàn)組來比對(duì)分析，經(jīng)過一系列處理后，研究對(duì)象對(duì)應(yīng)的目的基因表達(dá)是否受到影響,。例如下方例舉的藥物測(cè)試實(shí)驗(yàn)：
 
測(cè)試一款減少黑色素表達(dá)的藥物，該藥物以灌胃的形式給藥至實(shí)驗(yàn)組小鼠,，對(duì)照組小鼠僅以正常飲用水進(jìn)行灌胃,，以往大量研究已表明該藥物對(duì)于黑色素表達(dá)有明顯的抑制作用。

 

 

如果研究目的基因,，簡(jiǎn)單僅以兩組的目的基因表達(dá)量相比,，可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組生成黑色素的基因表達(dá)量相比于對(duì)照組要多四倍,。

 

 

然而已有大量研究證明該藥物抑制黑色素表達(dá),，與已有理論存在相悖的情況。存在該情況的原因可能主要是兩組小鼠RNA提取的時(shí)候處于不同的時(shí)間,、提取樣本量不一樣,、cDNA上樣量不一樣、cDNA濃度不一樣等等,。
 
為避免各類潛在差異帶來的影響,，需引入內(nèi)參基因,，可見上圖右半部分。同樣樣本,，在原測(cè)試目的基因的基礎(chǔ)上,，加測(cè)內(nèi)參基因。對(duì)照組得到的目的基因與內(nèi)參基因之間的模板比值為正常老鼠目的基因的比例關(guān)系,，理論狀態(tài)下,，以該比例×實(shí)驗(yàn)組老鼠恒定表達(dá)的內(nèi)參基因表達(dá)量即可獲得實(shí)驗(yàn)組老鼠在正常狀態(tài)下目的基因的理論表達(dá)量，實(shí)際實(shí)驗(yàn)組老鼠目的基因表達(dá)量除以理論表達(dá)值,，即可計(jì)算出老鼠在藥物處理下,，目的基因的表達(dá)量變化情況，具體如下：

 

 

以上結(jié)果可以得出,，實(shí)驗(yàn)組目的基因表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的1/2,，也符合以往研究報(bào)道。
 
以上是對(duì)熒光定量數(shù)據(jù)分析得介紹,，相信小伙伴們通過小翌的介紹,，對(duì)如何分析數(shù)據(jù)已經(jīng)有一定的了解啦。關(guān)于如何做好qPCR實(shí)驗(yàn),，小翌會(huì)陸續(xù)在公眾號(hào)里傳授秘籍噠,，敬請(qǐng)期待哦。

 

 

相關(guān)產(chǎn)品推薦

 

方法

分類

產(chǎn)品名稱

貨號(hào)

RNA提取

同Trizol提取

TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent

10606ES

動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取,，避開有毒試劑,，最快15 min完成

MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒

19221ES

簡(jiǎn)單植物總RNA提取，避開有毒試劑,，最快40min完成

MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒

19291ES

多糖多酚植物總RNA提取,，最快30min完成

MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒

19292ES

細(xì)胞總RNA提取,，避開有毒試劑,，最快8 min完成

MolPure® Cell RNA Kit 培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒

19231ES

qPCR染料法

高靈敏通用型定量預(yù)混液(染料法)

Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix

11184ES

定量預(yù)混液 (染料法)，已發(fā)文章累計(jì)IF達(dá)到5000+

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)

11201ES

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox)

11202ES

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox)

11203ES

高靈敏型qPCR預(yù)混液（染料法）

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)

11198ES

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox)

11199ES

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox)

11200ES

miRNA加A法高特異性定量預(yù)混液(染料法)

Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（加A法）

11171ES

miRNA莖環(huán)法高特異性定量預(yù)混液(染料法)

Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（莖環(huán)法）

11170ES

高靈敏一步法反轉(zhuǎn)定量試劑盒(染料法)

Hifair®  III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit

11143ES

細(xì)胞直擴(kuò)RT-qPCR,，1.5 h從細(xì)胞到基因表達(dá)分析(染料法)

Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit

11172ES

反轉(zhuǎn)錄試劑

5 min快速反轉(zhuǎn),，最長(zhǎng)可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-示蹤版New

Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit

11149ES

5 min快速反轉(zhuǎn),，最長(zhǎng)可滿足14 kb cDNA合成,，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-常規(guī)版New

Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye）

11150ES

15 min一步完成gDNA去除與反轉(zhuǎn)錄(下游應(yīng)用qPCR)

Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR

11142ES

鏈cDNA合成預(yù)混液，含gDNA去除(下游應(yīng)用qPCR)

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

11141ES

最長(zhǎng)可滿足19.8 kb cDNA合成試劑盒,，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

11139ES

常規(guī)30 min反轉(zhuǎn)預(yù)混液,含gDNA去除（下游應(yīng)用qPCR）

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

11123ES

miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（加A法）

Hifair®  miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法）

11148ES

 



會(huì)員登錄

×

請(qǐng)輸入賬號(hào)

請(qǐng)輸入密碼

=

請(qǐng)輸驗(yàn)證碼

收藏該商鋪

X
該信息已收藏,！
標(biāo)簽：
保存成功

(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)

常用：

提示

X
您的留言已提交成功！我們將在第一時(shí)間回復(fù)您~
產(chǎn)品對(duì)比 二維碼

掃一掃訪問手機(jī)商鋪

對(duì)比框

在線留言