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DNA甲基化是潛力的早篩及MRD的標(biāo)志物,，基于NGS的甲基化檢測(cè)中,，重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化是DNA甲基化檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)",，轉(zhuǎn)化率可達(dá)99.5%以上,，但重亞硫酸鹽處理會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的DNA損傷,、片段化及解鏈,。此外,，一些低質(zhì)量或嚴(yán)重降解的DNA（cfDNA、ctDNA,、FFPE DNA,、古生菌DNA等）中也含有大量的DNA單鏈，采用常規(guī)雙鏈建庫(kù),，文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率較低,，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量差。而單鏈建庫(kù)可以大幅提高DNA原始分子的利用率,，提高文庫(kù)的復(fù)雜性,，在低起始量樣本的甲基化文庫(kù)和基因組文庫(kù)構(gòu)建中具有顯著的優(yōu)勢(shì)。
圖1. 甲基化單鏈建庫(kù)流程圖
甲基化轉(zhuǎn)化：重亞硫酸鹽（Bisulfite）處理DNA,，使未甲基化的C轉(zhuǎn)化為U,；
變性：雙鏈DNA變性為單鏈DNA；
3’接頭連接：TdT末端轉(zhuǎn)移酶催化單鏈DNA的3’羥基端加上同聚物尾巴（poly C）,，E.coli DNA Ligase 連接3’接頭,；
二鏈合成：DNA Ploymerase I或Klenow Fragment進(jìn)行單鏈DNA互補(bǔ)鏈合成；
5’接頭連接：T4 DNA Ligase 連接5’接頭,；
文庫(kù)擴(kuò)增：耐U高保真DNA聚合酶擴(kuò)增,，獲取含有完整接頭序列的上機(jī)文庫(kù)。
翌圣通過(guò)ZymeEditor酶改造平臺(tái)對(duì)用于單鏈建庫(kù)的全套酶原料進(jìn)行性能提升及工藝優(yōu)化,，用于單鏈建庫(kù)可顯著提高文庫(kù)轉(zhuǎn)化率,，助力甲基化檢測(cè)。
圖2. 不同投入量gDNA建庫(kù)產(chǎn)量
圖3.不同投入量gDNA map率
圖4.不同投入量gDNA Dup率
對(duì)cfDNA及FFPE DNA樣本進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化,，使用翌圣全套建庫(kù)酶原料進(jìn)行單鏈建庫(kù)，結(jié)果顯示使用翌圣酶原料進(jìn)行單鏈建庫(kù),，文庫(kù)產(chǎn)量顯著優(yōu)于進(jìn)口品牌（圖5 A）,，map率（圖5 B）及Dup率（圖5 C）與進(jìn)口品牌相當(dāng),。
圖5. 不同樣本單鏈建庫(kù)產(chǎn)量、Map率及Dup率
單鏈建庫(kù)解決方案
| 產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
| 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 | Hieff® Mag DNA Methylation Bisulfite Kit | 12223ES |
| 3’端添加poly C | Terminal Deoxynucleotidyl Transferase末端轉(zhuǎn)移酶 | 10302ES |
| 3’接頭連接 | E. coli DNA ligase (60 U/μL) | 14955ES |
| Taq DNA Ligase | 11051ES | |
| DNA二鏈合成 | DNA polymerase I | 12903ES |
| Klenow Fragment | 14458ES | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | 14460ES | |
| 5’接頭連接 | Hieff® Quick T4 DNA Ligase | 10301ES |
| PCR文庫(kù)擴(kuò)增 | Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase (1 U/μL) | 10145ES |
| 完整甲基化建庫(kù)試劑盒 | Hieff NGS® Methyl-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® V2 | 12221ES |
