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熒光定量PCR是實驗室中出鏡率非常高的一種檢測方法。該方法通過在PCR體系中添加熒光基團來記錄DNA產(chǎn)物的累積情況,，從而達到對PCR過程進行實時監(jiān)控的目的,，并且可以通過數(shù)據(jù)分析計算出起始模板量，這就是“熒光定量"中“定量"一詞的來源,。
*1 OLIGO Primer Analysis Software
非特異性產(chǎn)物本身會和SYBR 染料結(jié)合導致熒光產(chǎn)生,，從而人為地改變反應的Ct值,。非特異性擴增可以通過競爭反應組分來影響反應效率，從而導致數(shù)據(jù)準確性降低,。引物二聚體是一類常見的非特異性擴增產(chǎn)物,。引物二聚體通常是由正向和反向引物之間的相互作用引起的，但也可能是正向-正向或反向-反向引物退火的結(jié)果,，或者單個引物自行折疊的結(jié)果,。如果二聚化以交錯的方式發(fā)生作用，則可能發(fā)生一些片段延伸,，導致產(chǎn)物接近預期靶標片段的大小,，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。
對于同一個基因名來說,，可能會有不同的isoform。isoform指的是,，對于同一個基因，它的mRNA有多種不同剪接方式,，這個時候表達出來的的蛋白可能會有不同,，所以小伙伴們在設(shè)計實驗的時候，一定要想清楚自己要做的是哪一個isoform,。
舉個“栗子"：比如說一個基因有四種不同的isoform,，如果大家想要檢測的是四種不同剪接方式轉(zhuǎn)錄本之和，那么設(shè)計引物時就要針對這四個isoform的共有序列設(shè)計,。如果只想檢測其中一種isoform，那就要在這個isoform與其他三個isoform的不同序列位置設(shè)計引物,。
跨越內(nèi)含子設(shè)計引物可以區(qū)分并且規(guī)避基因組DNA (gDNA)污染,。gDNA可能與目的轉(zhuǎn)錄本共擴增，產(chǎn)生無效的數(shù)據(jù),。在熒光定量PCR實驗中避免gDNA干擾的最佳方式是嚴謹?shù)囊镌O(shè)計,。
引物設(shè)計的序列最好選擇相鄰的外顯子或一端或兩端引物跨越內(nèi)含子設(shè)計。當上游和下游引物在同一外顯子內(nèi)發(fā)生退火時,，其可擴增DNA和RNA上對應的序列,。當引物在相鄰外顯子中退火時，只有cDNA會被擴增,，因為此時源自gDNA的擴增片段會包括內(nèi)含子序列,，導致擴增子太長，無法在熒光定量PCR的反應條件下有效擴增,。
以人基因組來說,，平均每個基因有8.8個外顯子和7.8個內(nèi)含子，80%的外顯子長度小于200bp,，少于10%的內(nèi)含子長度在1100bp以上,，不到0.01%的內(nèi)含子長度小于20bp。例如外顯子長度200bp,，為了兼顧擴增子長度,，我們可以把上游引物設(shè)置在外顯子1和外顯子2的中間,，下游引物設(shè)置在外顯子2的位置,。
以上是引物設(shè)計需要注意的問題，在初步設(shè)計好引物之后,，我們需要在NCBI上進行BLAST檢驗,，來確保產(chǎn)物的特異性。
打開NCBI，選擇“Gene",，輸入想要檢測的基因名稱,，我們以人基因“ALAD"為例。
會出現(xiàn)很多搜索結(jié)果,，我們選擇需要的種屬來源,，即“human"，如果你知道Gene ID（每個基因有且只有一個特定的ID,，類似于人的）,，也可以根據(jù)Gene ID來選擇。這里我們選擇搜索結(jié)果中的第一個,。
確定NM號點擊后,，可以看到這個isoform的一些基本信息。
例如：gene代表基因長度3129bp,，CDS代表編碼蛋白區(qū)域149-1141bp
以及此基因的序列,，如下圖所示。此序列就是設(shè)計引物時對應的模板,。
引物設(shè)計軟件有很多,，例如oligo7、Primer5,、Clone Manager等,，以及很多在線網(wǎng)站，例如Primerbank （）,、Primer3plus ,、NCBI 的Primer BLAST等。在手頭沒有安裝合適的軟件的時候,，我們可以選擇在線網(wǎng)站設(shè)計引物,。
這里以延續(xù)第一步使用NCBI確定靶基因的步驟為例。了解完我們所需的isoform后,，我們可以點擊右側(cè)的“Pick Primers",，就能直接進入Primer-BLAST的頁面進行引物設(shè)計了。
在彈出來的界面里粘貼模板序列或者輸入基因序列號,。另外需要設(shè)置“上下游引物位置"和“擴增子長度",。最主要的設(shè)置就是這兩點了，另外還有“物種名稱",、“數(shù)據(jù)庫"等其他選項可以設(shè)置,。
設(shè)置好之后，點擊頁面左下角的“Get Primers",。
彈出如下界面,，點擊“Check"
以第二步中使用的Primer-BLAST為例,，輸入設(shè)計好的上下游引物，其他參數(shù)不做調(diào)整改動,，提交后即可看到輸入的引物是否在其他基因上也存在,，若全部顯示在目標擴增的基因中,，說明引物的特異性達標。
以上是對qPCR擴增片段和引物設(shè)計的介紹,，相信小伙伴們通過小翌的介紹,，對如何設(shè)計擴增片段和引物已經(jīng)有一定的了解啦。關(guān)于如何做好qPCR實驗,，小翌會陸續(xù)在公眾號里傳授秘籍噠,，敬請期待哦。
方法 | 分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 |
RNA提取 | 同Trizol提取 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent | 10606ES |
動物組織/細胞總RNA提取,，避開有毒試劑,，最快15 min完成 | MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細胞/組織總RNA提取試劑盒 | 19221ES | |
簡單植物總RNA提取，避開有毒試劑,，最快40min完成 | MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒 | 19291ES | |
多糖多酚植物總RNA提取,，最快30min完成 | MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒 | 19292ES | |
細胞總RNA提取，避開有毒試劑,，最快8 min完成 | MolPure® Cell RNA Kit 培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒 | 19231ES | |
qPCR染料法 | 高靈敏通用型定量預混液(染料法) | Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | 11184ES |
定量預混液 (染料法),，已發(fā)文章累計IF達到5000+ | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11201ES | |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11202ES | ||
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11203ES | ||
高靈敏型qPCR預混液（染料法） | Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11198ES | |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11199ES | ||
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11200ES | ||
miRNA加A法高特異性定量預混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（加A法） | 11171ES | |
miRNA莖環(huán)法高特異性定量預混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（莖環(huán)法） | 11170ES | |
高靈敏一步法反轉(zhuǎn)定量試劑盒(染料法) | Hifair® III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit | 11143ES | |
細胞直擴RT-qPCR，1.5 h從細胞到基因表達分析(染料法) | Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit | 11172ES | |
反轉(zhuǎn)錄試劑 | 5 min快速反轉(zhuǎn),，最長可滿足14 kb cDNA合成,，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-示蹤版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11149ES |
5 min快速反轉(zhuǎn)，最長可滿足14 kb cDNA合成,，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-常規(guī)版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye） | 11150ES | |
15 min一步完成gDNA去除與反轉(zhuǎn)錄(下游應用qPCR) | Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR | 11142ES | |
高質(zhì)鏈cDNA合成預混液,，含gDNA去除(下游應用qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES | |
最長可滿足19.8 kb cDNA合成試劑盒，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) | 11139ES | |
常規(guī)30 min反轉(zhuǎn)預混液,含gDNA去除（下游應用qPCR） | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11123ES | |
miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（加A法） | Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法） | 11148ES |
