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不同SNP檢測技術(shù)的原理——ARMS、KASP,、TaqMan,、分子信標(biāo)及HRM
SNP檢測方法眾多,，大約有20多種,，包括基于陣列的雜交、PCR和測序等,，本文主要介紹基于PCR技術(shù)的部分基因分型方法,。
ARMS PCR的全稱是突變擴增阻滯系統(tǒng)PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR），也稱為等位基因特異性PCR（Allele-Specific PCR, AS-PCR），是基于Taq DNA聚合酶無法修復(fù)引物3’末端的單個堿基錯配,，從而使得擴增受阻的檢測方法,。
ARMS PCR將SNP位點設(shè)計在上游引物3’末端，結(jié)合Taqman探針的方法檢測熒光信號值,，從而判斷野生型和突變型等位基因,。換言之，我們應(yīng)用ARMS PCR對野生型和突變型等位基因進行檢測時,，需要設(shè)計兩條3’端核苷酸分別對野生型和突變型特異的上游引物,，以及一條通用的下游引物，一條通用的探針,。在Taq DNA聚合酶作用下,，與模板不能匹配的上游引物將不能形成互補堿基對，從而產(chǎn)生錯配,，鏈延伸反應(yīng)因3’,5’-磷酸二酯鍵形成障礙而受阻,，不能進行延伸，而與模板匹配的引物體系則可以持續(xù)延伸,，由于Taq酶5’到3’外切酶活性,，可將Taqman探針上的熒光基團水解，導(dǎo)致探針上熒光基團與淬滅基團的距離增大,，從而使得熒光信號被儀器檢測到,，最終計算出對應(yīng)的△Ct值。
圖2.ARMS-PCR檢測原理
圖3.四引物擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR檢測原理
引物探針設(shè)計
首先,，針對SNP的等位基因設(shè)計兩條對應(yīng)的上游引物，引物3’末端分別位于各自的SNP位點上,，同時引物5’端各自帶有一段的標(biāo)簽序列,，而下游引物則是一條常規(guī)設(shè)計共用的引物。引物一共是三條,，兩條帶有標(biāo)簽序列的分型上游及一條通用下游,。其次，設(shè)計兩條與上游引物標(biāo)簽序列一致的熒光探針,，探針的5’端分別標(biāo)記不同的熒光基團,，同時對應(yīng)于熒光探針設(shè)計各自互補配對的淬滅探針,，并在淬滅探針的3’端標(biāo)記淬滅基團，探針一共是四條,，兩條熒光探針和兩條淬滅探針,。
在第1輪PCR擴增中，等位基因特異引物（3'末端能配對的）就可識別特定等位基因模板,，完成等位基因識別,，反向通用引物也會結(jié)合并完成整個PCR過程，在此階段,，熒光探針仍與其互補的淬滅探針結(jié)合,，不會產(chǎn)生熒光信號。從第2輪PCR擴增開始,，產(chǎn)物中出現(xiàn)含有通用標(biāo)簽序列（tag sequence）的模板,，這步之后即可把通用標(biāo)簽序列引入與SNP對應(yīng)的PCR產(chǎn)物中。隨后熒光探針與tag互補的DNA鏈結(jié)合而添加到PCR產(chǎn)物中,，因此不再與其互補的淬滅探針結(jié)合,，從而產(chǎn)生熒光信號而被檢測到。
利用熒光信號檢測儀或熒光定量PCR儀（配有相應(yīng)熒光探針的檢測通道）進行信號讀取,，并用軟件采集信號判別等位基因類型（如果進行聚類分析,，要用到KlusterCaller或SNPviewer軟件）。
圖4.KASP法檢測原理
TaqMan探針是一種雙標(biāo)記,、自淬滅的水解探針,，在PCR反應(yīng)中加入兩條兩端帶有不同熒光標(biāo)記的特異探針來識別不同的等位基因。其5’和3’末端分別標(biāo)記熒光基團和淬滅基團,，在探針結(jié)構(gòu)完整時兩者距離較近,，熒光基團的信號可被淬滅。而在PCR擴增過程中,，若TaqMan探針與靶標(biāo)序列匹配,，探針則可結(jié)合在DNA模板上，此時Taq酶延伸至探針位置時,，其外切酶活性將切割水解探針,，釋放熒光基團，使得熒光信號增強,。而且,，隨著擴增產(chǎn)物的增多，熒光信號越來越強,，從而可通過儀器實時監(jiān)測熒光信號的變化過程,。
由于MGB探針的長度可以設(shè)計得更短（短至13個堿基），有利于提高探針的識別特異性,，因此用于檢測SNP的TaqMan探針常用MGB修飾,，在TaqMan探針的3’端結(jié)合小溝結(jié)合物（minor groove binder，MGB）,，MGB與DNA螺旋的小溝（minor groove）契合,，通過穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)來提高雜交的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,。另外MGB探針包括一個不發(fā)光的淬滅基團（NFQ）,，能夠真正消除傳統(tǒng)淬滅基團產(chǎn)生的背景熒光信號，提高信噪比,，提高檢測靈敏度,。
圖5 TaqMan探針法檢測原理
分子信標(biāo)是一段雙標(biāo)記的寡核苷酸探針,，其5’末端和3’末端分別標(biāo)記熒光基團和淬滅基團,，且探針5’端和3’端的部分堿基可互補配對，從而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),，使得熒光基團和淬滅基團相互靠近而熒光信號較低,。分子信標(biāo)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)部分包含SNP檢測位點，當(dāng)模板與分子信標(biāo)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的核酸序列匹配時,，分子信標(biāo)可與模板雜交形成伸展?fàn)顟B(tài),，從而導(dǎo)致熒光基團和淬滅基團的空間距離拉大，熒光信號增強,，因此可被儀器檢測,，并確定SNP位點。使用不同熒光基團標(biāo)記的分子信標(biāo),，則可區(qū)分SNP類型,。
圖6.分子信標(biāo)法檢測原理
分子信標(biāo)法與TaqMan探針法類似，均是通過探針中單個堿基的識別能力區(qū)分SNP,，只是分子信標(biāo)采用莖環(huán)結(jié)構(gòu),，而TaqMan探針使用MGB修飾，以提高探針對SNP的識別特異性,。該方法本底低,，特異性高，靈敏性高,，不必與未反應(yīng)的探針分離即可檢測,，可用于活體分析；但是探針合成時標(biāo)記較復(fù)雜,，設(shè)計難度大,。在進行分子信標(biāo)的研究和應(yīng)用時,莖干區(qū)和環(huán)狀區(qū)的序列設(shè)計是關(guān)鍵所在，這種設(shè)計不僅決定了其構(gòu)象,，使在雜交后淬滅基團與熒光基團之間的距離達到足夠大,，而且決定了其合適的使用溫度。其次,，環(huán)境pH值,、純度也是影響分子信標(biāo)的重要因素,，pH值過高，分子信標(biāo)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可能被破壞,，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
PCR擴增的熔解曲線取決于其擴增序列,，序列中一個堿基的突變都可以導(dǎo)致雙鏈DNA的解鏈溫度發(fā)生變化,，通過實時熒光定量PCR儀監(jiān)測這種細(xì)微的溫度變化，可以知道擴增的序列中是否有突變發(fā)生,，從而對其進行基因分型,。
高分辨率熔解曲線（high-resolution melting analysis, HRM）是通過特定染料與擴增特定的DNA區(qū)域，在高分辨率熔解條件下對擴增產(chǎn)物進行溫度升降,，通過熔解曲線的變化區(qū)分不同的基因型或等位基因,。HRM檢測通常使用飽和熒光染料（如：LC Green、LC Green Plus,、SYTO 9等）,，具有更強的DNA結(jié)合能力，且不影響PCR擴增,，在DNA解鏈過程中也不會發(fā)生重排,，使得熔解曲線具有更高的分辨率。
核酸片段的固有特性,，如DNA序列的長度,、GC含量和堿基互補性差異等，均能影響高分辨率熔解曲線,，而結(jié)合高精度熒光定量PCR儀,，其分辨精度則可達到對單個堿基差異的區(qū)分，從而可用于確定SNP位點,。
圖7.高分辨率熔解曲線法檢測SNP結(jié)果示意圖
該方法引物設(shè)計簡單,，且單堿基改變、插入,、缺失都能通過HRM來檢測,，實驗操作簡單，不需要探針,，成本相對較低,，并且可以發(fā)現(xiàn)未知突變（但不能知道具體的突變類型）。但是HRM技術(shù)對實驗儀器的溫度分辨率要求相當(dāng)高,，需要達到0.02~0.1℃,，每升高1℃采集熒光25次，以滿足對單堿基差異的區(qū)分,。對溫度均一性同樣要求較高,，Tm的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.020-0.264℃（孔間溫度均一性要達到0.264℃以內(nèi)才能保證HRM分析結(jié)果的準(zhǔn)確性）,，一般PCR兩孔間溫差在0.3~0.5℃，這就導(dǎo)致兩孔間最終熔解溫度相差較大,，無法保證HRM分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
翌圣生物作為上游原料企業(yè)，在分子酶領(lǐng)域深耕多年,，目前已開發(fā)了ARMS-PCR法及TaqMan探針法的SNP分型檢測通用原料,，已被下游廠家應(yīng)用于腫瘤伴隨診斷、藥物基因組學(xué),、單基因遺傳病,、疾病易感性研究等多個領(lǐng)域。
| 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 備注 |
| 2×Hieff Unicon® TaqMan SNP Genotyping Master Mix | 13152ES | TaqMan探針法 |
| 2×Hieff® Blood Direct TaqMan qPCR Master Mix(Low ROX) | 13095ES | |
| 2×Hieff Unicon® Multiplex ARMS qPCR Mix | 13755ES | ARMS-PCR法 |
| 2×Hieff Unicon® Multiplex ARMS qPCR Kit | 13229ES | |
| Hieff UNICON® HotStart Super Specific Taq DNA Polymerase | 14318ES | 單酶 |
| 10×Taq PCR Buffer(with MgCl2) | 11373ES | 通用Buffer |
通過上面SNP科普般的分享,，相信大家對部分主流SNP檢測方法及特點有了基本的了解,，那SNP主要在哪些應(yīng)用領(lǐng)域起作用，以及常見的SNP問題有哪些,，限于篇幅原因,，敬請期待下篇SNP干貨分享哦！
