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新品 | HEK293殘留DNA片段分析Kit,，輕松實現(xiàn)HCD片段大小質(zhì)控

2023-6-12　　閱讀(275)

HEK293細(xì)胞應(yīng)用及其殘留DNA質(zhì)控

HEK293細(xì)胞是一種人胚腎細(xì)胞系,，因其對生長和培養(yǎng)環(huán)境要求不高、易于轉(zhuǎn)染,，以及相比于常用的CHO細(xì)胞翻譯后修飾（PTM）能力更為強(qiáng)大的特點,，目前在工業(yè)內(nèi)也被廣泛用于抗體蛋白生產(chǎn)、疫苗中的病毒樣顆粒生產(chǎn),、細(xì)胞和基因治療中的病毒載體生產(chǎn)等領(lǐng)域,。但也有實驗證明，HEK293注入裸鼠中可成瘤,，所以HEK293宿主細(xì)胞殘留成分是生物制品質(zhì)量控制中一個重要環(huán)節(jié),，需要被控制在可接受的水平。

嚴(yán)格的純化工藝可以去除一部分宿主細(xì)胞DNA（HCD）等殘留雜質(zhì)成分,，但產(chǎn)品中仍然可能會有HCD殘留,，這些殘留的外源宿主細(xì)胞DNA會引發(fā)潛在的安全問題（如潛在致瘤性、傳染性,，甚至增加免疫源性或?qū)е峦蛔儯?，所以HCD檢測項目是生物制品生產(chǎn)工藝中重要的質(zhì)量檢測指標(biāo)之一。

殘留DNA風(fēng)險及法規(guī)監(jiān)管要求

WHO和各國藥物注冊監(jiān)管機(jī)構(gòu)均對生物制品中外源宿主DNA殘留提出了監(jiān)測和控制要求,，以確保生物制品的安全性及質(zhì)量可控性,。

WHO和美國FDA現(xiàn)行指導(dǎo)方針推薦成品中殘留DNA不高于10 ng/劑，美國FDA還指出生物制品宿主細(xì)胞DNA殘留DNA不高于100 pg/劑,。歐洲藥典通則規(guī)定生物制品殘留DNA限度大多為不超過10 ng/劑,。中國藥典2020年版三部規(guī)定，以細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的生物制劑外源宿主細(xì)胞DNA殘留量不能超過100 pg/劑，以細(xì)菌或真菌基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗DNA殘留量不能超過10 ng/劑,。

除需對DNA的殘留量進(jìn)行控制外,，DNA殘留片段大小分布也是確定其相關(guān)風(fēng)險因素的重要指標(biāo)。有研究表明,，一個功能基因至少在200bp以上,，因此大于200bp有可能會有一定的致病性，而且殘留DNA片段越大,，生物制品的風(fēng)險等級越高,。DNA片段大小對應(yīng)風(fēng)險等級如下表：

DNA片段大小風(fēng)險等級劃分

注：風(fēng)險程度依據(jù)風(fēng)險等級遞增

美國FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) 》行業(yè)指南中建議將非致瘤性連續(xù)細(xì)胞的殘留DNA量限制在10 ng/劑以下，DNA大小限制在約200bp以下,。

2022年5月,，國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心（CDE）發(fā)布的體內(nèi)基因治療產(chǎn)品要學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）中也明確指出，需對DNA殘留量和殘留片段大小進(jìn)行控制,，建議盡量將DNA殘留片段的大小控制在200bp以下,。

殘留DNA片段分析方法

目前，檢測宿主細(xì)胞殘留DNA含量的方法都相對成熟,，而且藥典法規(guī)也有明確規(guī)定,，如《中華人民共和國藥典》2020年版第三部規(guī)定，外源性DNA殘留檢測采用DNA探針雜交法,、熒光染料色法和定量PCR法,。

然而，關(guān)于殘留DNA片段大小的檢測與分析,，目前還沒有特定推薦的方法,。

目前，行業(yè)內(nèi)對于殘留宿主細(xì)胞DNA片段分析,，主要是利用毛細(xì)管電泳的方法,。研究者們開發(fā)了一種基于毛細(xì)管凝膠電泳與敏感激光誘導(dǎo)熒光（CGE-LIF）檢測殘留DNA分子大小的方法，可以檢測生物制品中殘留DNA的大小,，實驗表明,，大多數(shù)宿主細(xì)胞殘留DNA片段大小為50-2000bp。除了毛細(xì)管電泳法外,，實時熒光定量PCR（qPCR）法也被用于進(jìn)行生物制品中生產(chǎn)用細(xì)胞相關(guān)的DNA片段分布的分析,。且qPCR法相比于CGE-LIF操作更簡單，耗時更短,。

針對上述情況,，翌圣生物自主研發(fā)了HEK293殘留DNA片段分析試劑盒，采用熒光探針qPCR法原理,，設(shè)計了四種不同的擴(kuò)增片段（82bp,、133bp,、227bp、515bp）,，用于定量檢測樣本中HEK293宿主細(xì)胞殘留DNA片段的大小分布情況,。樣本類型包括：慢病毒上清液、腺相關(guān)病毒AAV上清液,、HEK293細(xì)胞裂解液等,。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動化核酸提取儀器,。

HEK293殘留DNA片段分析Kit產(chǎn)品性能

符合法規(guī)：按照Chp、USP,、ICH等要求進(jìn)行全面驗證,，性能符合中外法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)；

保障品質(zhì)：試劑盒原材料全自主研發(fā),，qPCR Mix等酶產(chǎn)品在超潔凈酶工廠生產(chǎn),；

配合審計：保障試劑盒生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，批間差可控,，有完善的審計文件,；

靈敏度高：定量限可達(dá)10fg/μL水平；

專屬性強(qiáng)：特異性檢測HEK293細(xì)胞殘留DNA,，不受其他外源基因組DNA干擾,；

防干擾強(qiáng)：添加UDG酶，消化常規(guī)產(chǎn)物氣溶膠污染,，防止非特異性擴(kuò)增

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品	貨號	品名	規(guī)格
樣本前處理試劑盒	18461ES	MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝）	25T/100T
	18462ES	MolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒FA（預(yù)封裝）	2×16T/6×16T

核酸提取儀器	80501ES	Auto-Pure 32A automated nucleic acid extraction system Auto-Pure 32A全自動核酸提取儀	32通量
殘留DNA片段分析試劑盒	41316ES	HEK293 Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit HEK293 宿主細(xì)胞殘留 DNA 片段分析試劑盒	4×50T/4×100T

參考文獻(xiàn)

[1]《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》,，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，2022年5月,。

[2] 閆璐瑤等,，宿主細(xì)胞殘留DNA片段大小分布檢測方法的建立及驗證[J].中國生物制品學(xué)雜志，2021年3月第34卷第3期,。

[3] U.S. FDA. Guidance for Industry: Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs).

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