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基質膠實驗應用——血管生成

2022-8-1　　閱讀(907)

分享：
血管生成（angiogenesis ）會與傷口愈合、炎癥,、類風濕性關節(jié)炎,、糖尿病視網(wǎng)膜病變、黃斑變性和腫瘤生長等存在著密切的關聯(lián),。在生物體生長過程中,，血管生成是新組織生長的重要組成部分。在成年期,，除在特殊器官中受到嚴格調節(jié)的周期性事件外,，由于促血管生成和抗血管生成內(nèi)源性因素之間的平衡,，幾乎每個正常組織都缺乏大量的生理性血管生成。當促血管生成方向的平衡被打亂時,，微血管內(nèi)皮細胞 (EC) 會轉變?yōu)檠苌杀硇?，從而開始血管生成反應，該反應可以被消除或加速,。


在研究過程中所涉及到血管生成實驗,，傳統(tǒng)的體內(nèi)血管生成實驗方法有：角膜微袋、腸系膜,、海綿/基質植入物,、圓盤分析 (DAS)、斑馬魚等,。但這些實驗不僅技術要求高,，成本昂貴,，耗時長,，還會涉及到道德倫理問題等。相較于體內(nèi)做血管生成實驗,，在體外利用特殊基質維持細胞生成血管是一種比較經(jīng)濟和實用的實驗[1],，其中的細胞生長維持基質物就是來源與EHS小鼠腫瘤中提取出的可溶性基底膜制備物——基質膠。


基質膠主要成分由層粘連蛋白,，Ⅳ型膠原,，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）和巢蛋白等組成，還包含生長因子如TGF-beta,、EGF,、IGF、FGF,、組織纖溶酶原激活物和EHS腫瘤自身含有的其他生長因子,。為組織和細胞提供支撐、抗拉強度和支架支撐,，也可以作為細胞粘附和運動的三維亞結構以及生長因子,、趨化因子和細胞因子的儲存庫，同時可作為細胞形態(tài)發(fā)生和分化的信號等,。翌圣生物開發(fā)生產(chǎn)的CeturegelTM基質膠不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒），超低內(nèi)毒素含量，并全部經(jīng)過支原體檢測保證無支原體污染,，包括基本濃度,、高濃度、低生長因子等不同類型基質膠,。 
 




應用方向

 


產(chǎn)品特點

 
安全性高：不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒）
濃度多樣性：濃度范圍在8~20 mg/mL之間
批次穩(wěn)定性好：嚴格生產(chǎn)質檢過程保證批次間性能穩(wěn)定
低內(nèi)毒素：內(nèi)毒素含量≤4 EU/mL
污染物檢測： 經(jīng)檢測無支原體和細菌,、真菌殘留
單批產(chǎn)量高：單批產(chǎn)量在L級別以上
兼容性好：可與任何類型的細胞培養(yǎng)基兼容



血管生成實驗


“

實驗步驟


01

基質膠準備


  1. 實驗前一天，從冷凍冰箱內(nèi)取出CeturegelTM基質膠并置于4℃冰箱過夜融化，同時對所使用的耗材預冷處理,。

  2. 實驗前將CeturegelTM基質膠始終放置在冰盒中,。

  3. 打開血管生成載玻片滅菌包裝，取出載玻片,。

  4. 向每孔內(nèi)加入10 μl CeturegelTM基質膠,，注意加入CeturegelTM基質膠時槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方，防止有基質膠流經(jīng)上孔而留下殘膠,。


02

凝膠


  1. 首先蓋上載玻片的蓋子,，準備一個10 cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾,，制成一個濕盒,。

  2. 將載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋,。

  3. 將整個培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱中,，靜置30min左右等待膠凝結，同時準備細胞懸液,。


03

細胞鋪板



  1. 將消化后的細胞制備成密度為2*105  cells/ml細胞懸液,，充分混勻。

  2. 將含有已經(jīng)凝固成膠狀的血管載玻片取出,。

  3. 每孔加入50μl的細胞懸液,，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠,。

  4. 加入細胞培養(yǎng)基,，蓋上蓋，靜置,，一段時間后,，所有細胞都會沉下去落在基質膠的表面。


04

圖像采集


按照細胞生長速度定時觀察拍照,、留存圖像,。


免疫熒光染色（選做）

  1. 小心移除孔內(nèi)培養(yǎng)基，切勿碰觸膠或者細胞網(wǎng)絡,。用無血清培養(yǎng)基稀釋鈣黃綠素使其終濃度為6~8 µg/ml,。

  2. 加入細胞染液使其*浸沒細胞，室溫,，避光孵育30~40分鐘,。

  3. PBS清洗三次，注意PBS要緩緩加入上孔,，以免沖擊掉細胞,。

  4. 使用Ex=485 nm,，Em=529 nm波長進行熒光觀察


05

結果統(tǒng)計


并對其成管長度、覆蓋面積,、成環(huán)數(shù),、結點數(shù)進行測量和記錄，并進行統(tǒng)計分析,。
 
圖片
圖：血管生成結果圖
 
圖片
圖：血管免疫熒光染色圖[2]



FAQ


01 拿到的基質有色差的變化（淡黃色到深紅色）是什么原因,？

對于含酚紅的基質膠主要原因是由于酚紅和碳酸氫鹽與CO2作用引起的，但是與5％CO2平衡后色差即會減少,。凍融后,，輕輕搖晃試劑瓶使基質膠分散均勻。


02 基質膠的操作要注意哪些事項,？

所有操作需在無菌環(huán)境下進行,，應使用預冷的移液器以保證基質膠呈勻漿狀。


03 基質膠的如何分裝凍存使用,？

可將凍融后的CeturegelTM基質膠分裝在多個小管,，所有分裝均需用預冷的凍存管，迅速冷凍并保存,，避免多次凍融,。所有涉及到使用的物品在使用前需預冷，使用預冷的移液管,、吸頭及小管等操作基質膠。


[1] Norrby K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 2006 Jul-Sep;10(3):588-612. doi: 10.1111/j.1582-4934.2006.tb00423.x.
[2] Benton G, Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Koblinski J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 2014 Dec 15;79-80:3-18. doi: 10.1016/j.addr.2014.06.005.



相關產(chǎn)品


產(chǎn)品類型

產(chǎn)品名稱

編號

規(guī)格

基本濃度

CeturegelTM Matrix LDEV-Free基質膠

40183ES08/10

5/10 mL

CeturegelTM Matrix Phenol Red-Free,，LDEV-Free 基質膠

40184ES08/10

5/10 mL

低生長因子

CeturegelTM Matrix GFR,，LDEV-Free 基質膠

40185ES08/10

5/10 mL

CeturegelTM Matrix GFR， Phenol Red-Free,，LDEV-Free 基質膠

40186ES08/10

5/10 mL

高濃度

CeturegelTM Matrix High Concentration,，LDEV-Free 基質膠

40187ES08/10

5/10 mL

CeturegelTM Matrix High Concentration，Phenol Red-Free,，LDEV-Free 基質膠

40188ES08/10

5/10 mL

CeturegelTM Matrix High Concentration,，GFR，LDEV-Free 基質膠

40189ES08/10

5/10 mL

干細胞專用

CeturegelTM Matrix hESC-Qualified,，LDEV-Free 基質膠

40190ES08/10

5/10 mL

類器官專用

CeturegelTM Matrix for Organoid culture,，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質膠

40191ES08/10

5/10 mL




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