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核酸檢測用到的核心酶原料，您了解嗎,？

2022-4-25　　閱讀(1444)

核酸檢測用到的核心酶原料,，您了解嗎？

2022年3月以來,，狡猾的奧密克戎變異毒株又一次打破了人們平靜的生活,，全國各地陸續(xù)爆發(fā)疫情，波及30個?。▍^(qū),、市）。核酸檢測作為疫情精準(zhǔn)防控的有效手段,，儼然已成為一種生活常態(tài),，“今天你核酸了嗎？"也轉(zhuǎn)變?yōu)槿藗兊娜粘柡蛘Z,。說到這,，大家了解核酸檢測中需要用到哪些核心原料嗎？本文就來介紹一下核酸檢測中最關(guān)鍵的核心原料-酶,。

圖片來源：攝圖網(wǎng)

核酸檢測流程

酶是一類極為重要的生物催化劑,，具有催化高效性和反應(yīng)特異性。絕大多數(shù)生化反應(yīng)均需要酶的參與,，核酸檢測也不例外,。在核酸檢測過程中（圖1所示），不同類型的分子酶在核酸檢測的不同實驗階段（核酸提取,、RT-qPCR）發(fā)揮了重要的作用,。

接下來，小翌根據(jù)核酸檢測中的不同實驗環(huán)節(jié)為大家梳理核酸檢測過程中用到的核心酶原料,。

圖1.核酸檢測流程

核酸提取過程中的核心酶

核酸提取過程主要包括裂解和純化兩大步驟：裂解是破壞樣品細(xì)胞結(jié)構(gòu),，從而使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程；純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分,，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)*分離,，反應(yīng)過程需要蛋白酶K（Proteinase K）,、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase I）及RNase抑制劑的參與。

蛋白酶K

蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶,，可切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵（圖2所示）,。在核酸提取過程中，蛋白酶K可降解與核酸緊密結(jié)合的組蛋白,，促進(jìn)核酸的分離,，使樣本核酸能更好的被提取,。另外，蛋白酶K可降解RNA水解酶（RNase）活性,，抑制RNase水解模板RNA,。

圖2.蛋白酶K水解肽鍵示意圖

翌圣生物蛋白酶K（Cat#10401ES）來源于基因重組酵母菌株，比活性≥30 U/mg蛋白,，不含RNase和DNase,，在尿素和SDS溶液中酶活性穩(wěn)定存在，在較廣的pH范圍內(nèi)（pH 4.0~12.0）均有活性,，適用于原位雜交樣本制備,，核酸純化等實驗中蛋白質(zhì)的切割清除。

脫氧核糖核酸酶Ⅰ

脫氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I, DNase I）可催化多種形式DNA,，靶向切割鄰近嘧啶的磷酸二酯鍵,，產(chǎn)生5’端為磷酸基團(tuán)、3’端為羥基的多聚核苷酸,，平均消化產(chǎn)物最小為多聚四核苷酸,。在核酸提取過程中，DNase I主要用于除去RNA樣本中的基因組污染,，避免RNA模板中存在DNA殘留,，提高模板純度。

翌圣生物DNase I（Cat#10325ES）來源于重組E. coli菌株,，不含RNase,，可以用于各種RNA樣品的處理，最佳的工作pH范圍是7-8,。在Mg²⁺存在下,，DNase I可隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點；而在Mn²⁺存在的條件下,，DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈,，形成平末端或有1-2個核苷酸突出的粘末端（圖3所示）。

圖3.DNase I在Mg²⁺以及Mn²⁺存在下可切割dsDNA原理圖

RNase抑制劑

在核酸檢測過程中,，樣本核酸的提取,、純化或?qū)嶒灥姆磻?yīng)體系配制的過程中，均有可能引入核糖核酸酶（RNase）的污染,，導(dǎo)致RNA模板被降解,。若要避免RNase的污染，則需要RNase 抑制劑（RNase Inhibitor）發(fā)揮作用,。

RNase Inhibitor是人的胎盤中存在的一種特異性RNase抑制劑,，能夠特異地與RNase以非共價鍵結(jié)合形成復(fù)合體從而使RNase失活。翌圣生物鼠源RNase抑制劑Murine RNase Inhibitor（Cat#10603ES）不含人源蛋白中的兩個對氧化非常敏感的半胱氨酸,，具有更高的抗氧化活性,，能夠廣泛抑制各種類型RNase(RNase A, B, C),，更加適合于對高二硫蘇糖醇（DTT）敏感性的實驗如qPCR反應(yīng)。

RT-qPCR過程中的核心酶

在完成樣本核酸提取后,，可通過RT-qPCR來完成核酸的檢測,。在這些實驗過程中，DNA聚合酶,、逆轉(zhuǎn)錄酶,、尿嘧啶DNA糖基化酶都是的核心酶原料。

逆轉(zhuǎn)錄酶

提取純化后RNA,，在進(jìn)行qPCR反應(yīng)前需先通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化dNTP聚合（即RT-Reverse Transcription,，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），生成與模板RNA互補(bǔ)的cDNA序列（圖4）,。對于RT-qPCR反應(yīng),，應(yīng)選擇可耐高溫的逆轉(zhuǎn)錄酶，目前市面上應(yīng)用*泛的為MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶,，因其缺乏DNA內(nèi)切酶活性且RNase H活性較低,，在cDNA克隆應(yīng)用中更有優(yōu)勢。

圖4.逆轉(zhuǎn)錄過程示意圖

翌圣生物Hifair® V Reverse Transcriptase 第五代耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶（Cat#11300ES）是通過基因工程技術(shù)得到的全新逆轉(zhuǎn)錄酶,，熱穩(wěn)定性好,，可耐受高達(dá)60℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄,。同時,，該酶增強(qiáng)了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄,，可擴(kuò)增長達(dá)10 kb的cDNA,。

DNA聚合酶

完成模板逆轉(zhuǎn)錄過程生成雙鏈cDNA以后，就需要PCR反應(yīng)中的“靈魂選手"DNA聚合酶閃亮登場,，通過聚合游離的脫氧核糖核苷酸進(jìn)行DNA鏈的延伸,，在體外完成模板DNA的大量擴(kuò)增，實現(xiàn)病毒核酸可被檢測的目的,。

在RT-qPCR反應(yīng)中常用的DNA聚合酶為熱啟動Taq DNA聚合酶,，該類酶在常溫條件下無活性，只有經(jīng)過熱啟動以后才具有聚合活性,，可以最大限度地減少背景信號的生成,，很好的解決了常規(guī)PCR反應(yīng)中引物二聚體產(chǎn)生或錯配引起的非特異性擴(kuò)增等問題。目前市面上常用的DNA聚合酶熱啟動修飾方法主要有化學(xué)修飾,、配體修飾和抗體修飾等,，不同的熱啟動修飾方法原理如圖5所示,。

圖5.不同類型修飾熱啟動酶原理圖

翌圣Hieff UNICON® Hotstart High Specific Taq DNA Polymerase, 5 U/μL（Cat#10726ES）是雙抗體進(jìn)行雙封閉的熱啟動DNA聚合酶,，具有高模板親和力,。在常溫下不僅封閉了5'→3'聚合酶活性，同時也封閉了5'→3'核酸外切酶活性,。在95℃條件下變性30sec其封閉抗體即可*失活,，釋放出DNA聚合酶活性和核酸外切酶活性。雙封閉特性不僅能有效防止錯配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增,，又能有效抑制探針降解產(chǎn)生的熒光信號下降,，雙重保障使體外檢測試劑在運輸或室溫使用過程中更加穩(wěn)定。

尿嘧啶DNA糖基化酶

在核酸檢測過程中,，操作環(huán)境中的氣溶膠污染是造成PCR結(jié)果假陽性最常見的因素,，在擴(kuò)增體系中加入UDG酶（Uracil DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶）則可有效消除PCR體系中混入的擴(kuò)增殘留污染物（多以氣溶膠形式存在）,，保證擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性,。UDG酶防污染原理如圖6所示。

圖6.UDG酶防污染原理示意圖

翌圣生物熱敏UDG酶（Cat#10303ES）在25-37℃發(fā)揮活性,，熱敏感,，50℃ 10 min或95℃ 2 min即發(fā)生不可逆滅活。無核酸內(nèi)外切酶和RNase殘留,，宿主菌基因組殘留低于10拷貝,，與熱啟動Taq DNA聚合酶搭配使用，可保證擴(kuò)增反應(yīng)的特異性,。

翌圣生物-核酸檢測-核心酶匯總

流程	描述	產(chǎn)品名稱	貨號
樣本處理	蛋白消化	Proteinase K	10401ES
	RNA提取	Recombinant DNase I (RNase-free)	10325ES
	RNase抑制	Murine RNase Inhibitor (40U/μL)	10603ES
逆轉(zhuǎn)錄	適合RT-qPCR	Hifair^® V Reverse Transcriptase (200U/μL)	11300ES
逆轉(zhuǎn)錄	適合RT-qPCR	Hifair^® V Reverse Transcriptase (600U/μL) GLyceroL-free	11301ES
PCR擴(kuò)增	熱啟動DNA聚合酶	Hieff UNICON^® Hotstart High Specific Taq DNA Polymerase, 5 U/μL	10726ES
PCR擴(kuò)增	熱敏型UDG	Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), heat-labile,1U/μL	10303ES

大家總說,，如今的幸福標(biāo)準(zhǔn)是核酸-陰著、健康碼-綠著,、臉上-笑著,。我們相信，疫情終會過去,，讓我們?yōu)樵缛諔?zhàn)勝疫情,，共享美好時光而努力吧！

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